Name: drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model
Uploaded: 2017-01-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model at JoVE.com

Ce projet a été financé par des subventions du ministère singapourien de l&#39;Education (MOE, numéro de subvention 2013-T2-2-126) et l&#39;Institut national de la santé, États-Unis (NIH, numéro 1R21AT008452-01A1 accorder). TY a reçu une bourse d&#39;études supérieures du Département des sciences biologiques NUS. Nous remercions l&#39;unité confocale du Centre NUS pour les sciences BioImaging (CBIS) pour leur soutien constant.

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux protocoles de l&#39;Université nationale de Singapour (R14-293) Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) approuvés. 1. Les poissons Elevage et la collecte d&#39;embryons <ol><li> Soulever WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: CFP 24 et osx: mCherry 21 simple ou medaka poisson composé transgénique à 26 ° C sous un cycle de lumière contrôlée (14 h ...

<ol>
	<li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+fish+and+men:+using+zebrafish+to+fight+human+diseases.">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).</li><li>Ansai, S., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+using+CRISPR/Cas+system+in+medaka.">Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka.</a> Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).</li><li>Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+bones+are+created+equal-using+zebrafish+and+other+teleost+species+in+osteogenesis+research.">Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research.</a> Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).</li><li>Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+promoter+construct+for+heat-inducible+misexpression+during+fish+embryogenesis.">An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis.</a> Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+multipotency+and+preferential+asymmetric+divisions+in+post-embryonic+neural+stem+cells+of+the+fish+retina.">Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina.</a> Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).</li><li>Charles, J. F., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts:+more+than+'bone+eaters.">Osteoclasts: more than 'bone eaters.</a> Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).</li><li>DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sp7:EGFP:+a+transgenic+for+studying+otic+vesicle+formation,+skeletogenesis,+and+bone+regeneration.">Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration.</a> Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).</li><li>Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+normal+and+defective+bone+development+in+zebrafish+embryos+using+the+fluorescent+chromophore+calcein.">Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein.</a> Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).</li><li>Eriksen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+bone+remodeling.">Cellular mechanisms of bone remodeling.</a> Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).</li><li>Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+embryogenesis:+a+perspective+for+light+sheet+microscopy.">Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+teleost+intervertebral+region+acts+as+a+growth+center+of+the+centrum:+in+vivo+visualization+of+osteoblasts+and+their+progenitors+in+transgenic+fish.">The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).</li><li>Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+transgenesis+and+enhancer+activity+tests+in+medaka+using+PhiC31+integrase.">Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase.</a> Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).</li><li>Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+genetic+toolbox+of+the+teleost+medaka+(Oryzias+latipes).">The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes).</a> Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+osteoporosis.">Animal models for osteoporosis.</a> Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).</li><li>Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bone+to+pick+with+zebrafish.">A bone to pick with zebrafish.</a> Bonekey Rep. 2, 445 (2013).</li><li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+tools+for+drug+discovery.">Zebrafish as tools for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).</li><li>Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+col10a1:nlGFP+transgenic+line+displays+putative+osteoblast+precursors+at+the+medaka+notochordal+sheath+prior+to+mineralization.">A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization.</a> Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).</li><li>Renn, J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix-mCherry+transgenic+medaka+for+in+vivo+imaging+of+bone+formation.">Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation.</a> Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rankl-induced+osteoclastogenesis+leads+to+loss+of+mineralization+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model.</a> Development. 139 (1), 141-150 (2012).</li><li>Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+see-through+medaka:+a+fish+model+that+is+transparent+throughout+life.">The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).</li><li>Witten, P. E., Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+on+mechanisms+and+functions+of+skeletal+remodelling+in+teleost+fish,+with+special+emphasis+on+osteoclasts+and+their+function.">A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).</li><li>Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+osteoclast+inhibition+by+bisphosphonates+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).</li></ol>

Étapes critiques dans le Protocole Il est essentiel que les conditions pour le traitement de choc thermique sont cohérentes et stables lorsque l&#39;on compare les différents échantillons. Des conditions de température stables assurent des niveaux similaires de RANKL induction dans les larves transgéniques et, par conséquent, la formation des ostéoclastes comparables, ce qui peut être confirmé par criblage ctsk: Expression nlGFP. En fin de compte, ce qui conduit à un degré ...

Le squelette vertébré fournit un support structurel et de protection des organes, permet la mobilité, et sert de source de calcium. Tout au long de la vie, la matrice osseuse extracellulaire est continuellement remis à maintenir la stabilité et la rigidité osseuse. Ce processus nécessite l&#39;activité étroitement coordonnée et interaction des ostéoblastes osseuses formant et ostéoclastes résorption osseuse. Les ostéoblastes sont dérivées de progéniteurs mésenchymateuses multipotentes et produisent du collagène pour former le ostéoïde, la partie protéique de la matrice osseuse 10. Ostéoblastes interagissent avec les ostéoclastes pour parvenir à une activité équilibrée des deux types de cellules, ce qui est nécessaire pour contrôler l&#39; homéostasie osseuse 7. Du fait de ces interactions régulatrices complexes, les réponses au traitement de la toxicomanie et de l&#39; homéostasie osseuse ne peuvent être complètement examinés à l&#39; aide des études in vitro. Par conséquent, il existe une forte demande pour des modèles animaux. En comparaison avec les paramètres de culture cellulaire, des modèles in vivo peut fournirdes informations précieuses sur les réseaux multicellulaires au sein de l&#39;environnement de l&#39;os. De nombreux modèles de souris existent pour une variété de troubles osseux humains , y compris l&#39; ostéoporose 16. Toutefois, la taille et l&#39;accessibilité des embryons de souris représentent des limitations significatives pour l&#39;imagerie en temps réel des processus squelettiques. Les petits poissons téléostéens, d&#39;autre part, de servir comme une alternative intéressante pour l&#39; imagerie in vivo. Zebrafish (Danio rerio) et medaka (Oryzias latipes) sont devenus des modèles animaux populaires pour la recherche du squelette au cours des deux dernières décennies 17, 19, 22, 24. Os dans les poissons téléostéens et chez les mammifères est très similaire, à la fois sur une structure et sur le plan physiologique, et la plupart des gènes régulateurs clés et les voies de signalisation sont conservés 3. Comme chez les mammifères, les poissons téléostéens réguler soigneusement l&#39;activité des ostéoblastes et les ostéoclastes pour équilibrer la formation osseuse et la résorption 26. Plus important encore, la clarté optique de fiLes larves sh permet l&#39;utilisation de rapporteurs fluorescents pour marquer les cellules osseuses et la matrice calcifiée squelettique 8, 9, 12, 21, 23, ce qui facilite l&#39;observation des processus cellulaires chez l&#39;animal vivant. En outre, une série d&#39;outils génétiques a été généré pour faciliter la recherche biomédicale pertinente dans le poisson. Pour medaka en particulier, les méthodes pour la mutation du gène ciblé par CRISPR / cas9 2, cellule-lignage traçage 6, et transgénèse 14 ont été récemment mis en place et sont maintenant largement utilisées 15 spécifique au site. Les larves de petite téléostéens ont été utilisés avec succès pour les écrans chimiques, qui ont conduit à la découverte de plusieurs médicaments pharmacologiquement pertinentes 1, 18. Les larves de poissons sont tolérantes à de faibles concentrations de DMSO et sont capables d&#39;absorber des composés à partir de leur environnement aquatique, que ce soit à travers la peau ou dans le tractus gastro - intestinal 1, 5. Notre laboratoire précédemment repdes lignes de medaka transgéniques qui expriment SOUTENUS reporters fluorescents dans les cellules osseuses sous le contrôle de divers osteoblast- et des promoteurs spécifiques des ostéoclastes. Ceux - ci comprennent les ostéoblastes prématurés (collagène 10a1, col10a1; osterix, osx) 20, 21, ostéoblastes matures (ostéocalcine, osc) 27, et les ostéoclastes (cathepsine K, ctsk) 24. Nous avons également généré une lignée transgénique qui exprime le facteur d&#39;ostéoclastes induisant Activator Receptor du nucléaire facteur kB Ligand (RANKL) sous le contrôle d&#39;un choc promoteur inductible de chaleur 24. L&#39;induction de RANKL dans ce système conduit à la formation ectopique des ostéoclastes actifs. Cela conduit à une augmentation de la résorption osseuse et un phénotype de l&#39;ostéoporose comme sévère, avec considérablement réduit la minéralisation dans les corps vertébraux. Nous avons récemment montré que l&#39;activité des ostéoclastes dans ce modèle peut être bloqué par le bisphosphonates étidronate et l&#39;alendronate, two les médicaments couramment utilisés dans le traitement de l&#39; ostéoporose humaine, validant ainsi médaka comme système de modèle approprié pour l&#39; ostéoporose 27. En raison de leur grande taille de la couvée, le développement rapide, et la petite taille des embryons, larves de medaka transgéniques sont particulièrement adaptés pour le criblage à grande échelle de médicaments contre l&#39;ostéoporose et pour l&#39;analyse in vivo du comportement des cellules osseuses. Des études en medaka peuvent donc compléter efficacement les expériences dans des cultures cellulaires et chez les souris qui sont destinées à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies pour les troubles osseux humains. Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour traiter medaka larves os reporter du médicament contre l&#39;ostéoporose commune, alendronate. Nous décrivons également en détail comment les larves traitées sont montés et préparés pour l&#39;imagerie en direct de la matrice osseuse et les cellules osseuses. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés à d&#39;autres petits composés chimiques qui travaillent soit comme anabolisant de l&#39;os ou de la drogue antirésorptifs. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Alendronate&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A4978</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ (1.4.3.67)</td>
			<td style="width:177px;">National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM 510 Meta confocal&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM Image Browser (4.2.0.121)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">NIS-Elements BR 3.0 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">SMZ1000 stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Formation osseuse d&#39;ostéoblastes interagissent avec les ostéoclastes résorbent l&#39;os afin de coordonner la rotation de la matrice osseuse, et pour contrôler l&#39;homéostasie du squelette. Medaka et larves de poisson zèbre sont largement utilisés pour analyser le comportement des cellules osseuses lors de la formation osseuse, la dégénérescence et la réparation. Leur limpidité optique permet la visualisation de cellules marquées par fluorescence des os et des colorants fluorescents liés à la matrice osseuse minéralisée. Notre laboratoire a généré medaka transgénique poissons qui expriment le facteur de ostéoclastes induisant Activator Receptor du nucléaire facteur kB Ligand (RANKL) sous le contrôle d&#39;un promoteur de choc inductible chaleur. L&#39; expression ectopique des résultats de RANKL dans l&#39;excès de la formation des ostéoclastes activés, qui peuvent être visualisés dans des lignées rapporteuses d&#39;expression nlGFP sous le contrôle de la cathepsine K (ctsk) promoteur. induction de RANKL et la formation des ostéoclastes ectopique conduit à de graves phénotypes de l&#39;ostéoporose comme. Composé transgénique médaka linda qui expriment ctsk: nlGFP dans les ostéoclastes, ainsi que mCherry sous le contrôle de l&#39;osterix (osx) promoteur dans les ostéoblastes prématurés, peuvent être utilisés pour étudier l&#39;interaction des deux types de cellules. Ceci facilite l&#39;observation in vivo du comportement cellulaire dans des conditions de dégénérescence osseuse et la réparation. Ici, nous décrivons l&#39;utilisation de ce système pour tester un médicament couramment utilisé dans le traitement de l&#39;ostéoporose humaine et décrivent un protocole d&#39;imagerie en temps réel. Le modèle de medaka complète les études de culture et de souris cellulaire, et offre un nouveau système pour l&#39;analyse in vivo de l&#39; action de la drogue dans le système squelettique.

nombre d&#39;œufs abondantes, ainsi que la petite taille des larves, font medaka un excellent modèle pour le dépistage des drogues. Une plaque à six puits unique a été utilisé pour la culture jusqu&#39;à 36 larves, ce qui est suffisant pour fournir des données statistiquement significatives. Un autre grand avantage de l&#39;utilisation du poisson pour l&#39;analyse du squelette est la possibilité de faire l&#39;imagerie en direct. La transparence des larves de poisson permet d&#39;utiliser des protéines fluor...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Traitement de la toxicomanie et<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie des ostéoblastes-ostéoclastes Interactions dans un modèle Medaka poisson Ostéoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

The overall goals of this procedure are to use the embryos of transgenic Medaka bone reporter lines for drug testing and for live imaging of bone-cell behavior after the induction of osteoporosis like conditions. This method can help answer key questions in skeletal research such as how do different type of bone cells interact with each other in vivo? The main advantage of this technique is that the optical clarity of Medaka larvae allows live imaging of bone-cell behavior in an intact specimen.The implications of this technique extends towards the development of novel therapeutics for common bone diseases as it allows the visualization of long term effects of drug treatment in C2.All procedures described in this video were approved by IACUC of the National University of Singapore. To harvest the embryos during the first few hours of the light cycle, first use a fine meshed net to capture female adults carrying an egg cluster. Let the fish briefly rest in the net, and then gently massage the fish's abdomen to carefully strip the fertilized egg cluster from the abdomen of the female.Transfer 20 to 30 eggs into individual plastic 60 millimeter petri dishes, and use a plastic pipette to rinse the embryos in each plate with 5 to 10 milliliters of daneous solution. Gently roll egg cluster to form a knot of attachment filaments. Using forceps, carefully remove the attachment filaments from the fertilized egg clusters to obtain individual embryos.Then, culture the embryos in a 28 degrees Celsius incubator with daily medium changes to ensure normal embryonic development. For transgenic embryo screening, at two days post fertilization or later, heat shock the larvae for 20 minutes at 39 degrees Celsius. Then, use a stereo microscope equipped with a mercury lamp for fluorescence imaging to identify ubiquitous CFP expression.On day 5 post fertilization, mCherry reporter expression can be observed in osteoblasts of the early forming cranial bones on both sides of the posterior head and at a central position in the ventral cranium. Starting from day 6 post fertilization, robust nlGFP expression can be visualized in cathepsin positive cells of the head and tail. For the induction of an osteoporosis-like phenotype, subject the embryos to a 1.5 to 2 hour heat shock treatment at 9 days post fertilization or later to induce large numbers of ectopic osteoclasts in the trunk region.For bisphosphonate treatment, first transfer 6 Medaka larvae per well into a 6-well plate. Then use a clean, plastic pipette to carefully remove the fish medium. Add approximately 0.5 milliliters of bisphosphonate to each well to dilute any traces of medium.Then replace the wash solution with 4 milliliters of fresh bisphosphonate solution, and return the larvae to the incubator with daily medium changes for 2 to 6 days. At the appropriate experimental time point, filter freshly prepared bone staining solution through a single use 0.2 micron strainer. And incubate the larvae in a 1 and 10 dilution of the stain in fresh fish medium, for the appropriate staining period in a 28 degree Celsius incubator in the dark.At the end of the incubation, use a clean plastic pipette to transfer the larvae into fresh fish medium, and replace the stain contaminated medium with another aliquot of fresh medium. When there is no visible stain left in the medium, allow the larvae to rest in the fish medium for 30 to 60 minutes before imaging. For live fluorescence imaging of the Medaka larvae, use a plastic microloader to orient the anesthetized larvae according to the region of interest.And place them under a stereo microscope with fluorescence illumination. Select the appropriate magnification and image individual sections of each larvae using a suitable image processing software to stitch together the images at the appropriate overlapping regions. After each larvae has been imaged, return the animal to its well in the 6-well plate in fresh fish medium for recovery.For live confocal imaging, add 0.5 to 1 milliliter of 30 degree Celsius 1.5%liquid low melting agarose in fish medium to a glass bottom petri dish. Before the agarose solidifies, transfer an anesthetized larvae to the agarose and use a plastic microloader to push the larvae to the bottom of the dish. And use the yoke extension to orient the larvae according to the region of interest.After the agar has solidified, image the larvae by confocal microscopy. Then, use a pair of fine syringe needles to release the larvae from the agarose. And transfer each larvae and residually attached agarose into a new petri dish containing fresh fish medium for recovery.In these images, triple transgenic larvae were used for the simultaneous detection of premature osteoblasts and differentiated osteoclasts. Overview images were taken with a stereo microscope, while confocal microscopy was used to visualize processes at the cellular level. ALC stained bone matrix along the neural arches and sentry, was used as a reference for determining the position of the fluorescently labeled bone cells.RankL induction resulted in extensive formation of ectopic osteoclasts around the vertebral bodies. These excessive osteoclasts cause an osteoporosis-like phenotype which are observed as cavities in the mineralized centra, and as absent mineralization in the neural arches. After incubation in alendronate, osteoclasts formed normally but vertebral columns are intact, with no lesions and fully mineralized arches suggesting an efficient inhibition of osteoclast activity.Further, successive staining of the bone matrix with ALC followed by calcein, reveals a de novo mineralized bone matrix, with a simultaneous visualization of the osteoclasts and osteoblasts in the same intact larvae. Once mastered, this technique can be completed in 3 days from the induction of the osteoporotic lesions, until the imaging of the drug effect if it is performed properly. While attempting this procedure, it is important to remember to handle the living larvae with extreme care and to mound the larvae properly so that the region of interest will be in one focal plane.Following this procedure, other methods like noninvasive sulfate checking of individual bone precursor sites can be performed to answer additional questions such as bone-cell origin, activation, and attraction to the lesion sites for subsequent bone repair. After the development of this technique, it pave the way for scientists in the field of bone research to explore the effects of various chemical compounds, or genetic mutations on the dynamic behavior of cells during bone homeostasis. After watching this video, you should now have a good understanding of how to use Medaka bone transgenic lines for drug screening and live imaging of bone-cell behavior.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

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Recherche

Biologie du développement

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