Name: drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model
Uploaded: 2017-01-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי תרומות של סינגפור משרד החינוך (משרד החינוך, מספר מענק 2013-T2-2-126) והמכון הלאומי לבריאות, ארה&quot;ב (NIH, להעניק מספר 1R21AT008452-01A1). TY קיבל מלגה לתואר שני מהמחלקה NUS של מדעי הביולוגיה. אנו מודים יחידת confocal של מרכז NUS למדעי bioimaging (CBIS) בתמיכה המתמשכת שלהם.

כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים אישרה ועדת שימוש (IACUC) פרוטוקולים של האוניברסיטה הלאומית של סינגפור (R14-293). 1. בעלי דגים ואת האוסף של עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרי WT, ctsk: 24 nlGFP, <...

<ol>
	<li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+fish+and+men:+using+zebrafish+to+fight+human+diseases.">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).</li><li>Ansai, S., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+using+CRISPR/Cas+system+in+medaka.">Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka.</a> Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).</li><li>Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+bones+are+created+equal-using+zebrafish+and+other+teleost+species+in+osteogenesis+research.">Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research.</a> Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).</li><li>Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+promoter+construct+for+heat-inducible+misexpression+during+fish+embryogenesis.">An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis.</a> Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+multipotency+and+preferential+asymmetric+divisions+in+post-embryonic+neural+stem+cells+of+the+fish+retina.">Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina.</a> Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).</li><li>Charles, J. F., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts:+more+than+'bone+eaters.">Osteoclasts: more than 'bone eaters.</a> Trends Mol Med. 20 (8), 449-459 (2014).</li><li>DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sp7:EGFP:+a+transgenic+for+studying+otic+vesicle+formation,+skeletogenesis,+and+bone+regeneration.">Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration.</a> Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).</li><li>Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+normal+and+defective+bone+development+in+zebrafish+embryos+using+the+fluorescent+chromophore+calcein.">Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein.</a> Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).</li><li>Eriksen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+bone+remodeling.">Cellular mechanisms of bone remodeling.</a> Rev Endocr Metab Disord. 11 (4), 219-227 (2010).</li><li>Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+embryogenesis:+a+perspective+for+light+sheet+microscopy.">Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy.</a> Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).</li><li>Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+teleost+intervertebral+region+acts+as+a+growth+center+of+the+centrum:+in+vivo+visualization+of+osteoblasts+and+their+progenitors+in+transgenic+fish.">The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).</li><li>Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+transgenesis+and+enhancer+activity+tests+in+medaka+using+PhiC31+integrase.">Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase.</a> Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).</li><li>Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+and+genetic+toolbox+of+the+teleost+medaka+(Oryzias+latipes).">The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes).</a> Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+osteoporosis.">Animal models for osteoporosis.</a> Eur J Pharmacol. 759, 287-294 (2015).</li><li>Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bone+to+pick+with+zebrafish.">A bone to pick with zebrafish.</a> Bonekey Rep. 2, 445 (2013).</li><li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+tools+for+drug+discovery.">Zebrafish as tools for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).</li><li>Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+col10a1:nlGFP+transgenic+line+displays+putative+osteoblast+precursors+at+the+medaka+notochordal+sheath+prior+to+mineralization.">A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization.</a> Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).</li><li>Renn, J., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix-mCherry+transgenic+medaka+for+in+vivo+imaging+of+bone+formation.">Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation.</a> Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rankl-induced+osteoclastogenesis+leads+to+loss+of+mineralization+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model.</a> Development. 139 (1), 141-150 (2012).</li><li>Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+see-through+medaka:+a+fish+model+that+is+transparent+throughout+life.">The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).</li><li>Witten, P. E., Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+on+mechanisms+and+functions+of+skeletal+remodelling+in+teleost+fish,+with+special+emphasis+on+osteoclasts+and+their+function.">A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).</li><li>Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+osteoclast+inhibition+by+bisphosphonates+in+a+medaka+osteoporosis+model.">Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).</li></ol>

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול זה חיוני כי התנאים לטיפול הלם חום הם עקביים ויציבים כאשר משווים מדגמים שונים. בתנאי טמפרטורה יציבים להבטיח רמות דומות של אינדוקצית RANKL ב הזחלים המהונדסים, וכתוצאה מכך, היווצרות osteoclast דומה, אשר יכול להי?...

שלד החוליות מספק תמיכה מבנית והגנה על איברים, מאפשר ניידות, ומשמש מקור לסידן. לכל אורך חייו, מטריצת העצם התאית מופעלת מעל רף כדי לשמור על יציבות עצם ונוקש. תהליך זה דורש פעילות מתואמת בחוזקה הגומלין של אוסטאובלסטים יוצרי העצם osteoclasts-resorbing העצם. Osteoblasts נגזרות אבות mesenchymal מולטיפוטנטיים ולייצר קולגן ליצירת דמוי עצם, החלק חלבוניים של מטריקס העצם 10. Osteoblasts אינטראקציה עם osteoclasts להשיג פעילות מאוזנת של שני סוגי התאים, אשר נדרש שליטת עצם הומאוסטזיס 7. בגלל אינטראקציות רגולציה המורכבות האלו, תגובות טיפול תרופתי הומאוסטזיס עצם לא ניתן לבדוק באופן מלא באמצעות במבחנה. לפיכך, קיימת דרישה חזקה במודלים של בעלי חיים. בהשוואה להגדרות תרבית תאים, במודלים vivo יכול לספקתובנה חשובה רשתות רבות-תאי בתוך סביבת העצם. במודלים של עכברים רבים קיימים עבור מגוון רחב של הפרעות עצמות אדם כוללים אוסטאופורוזיס 16. עם זאת, הגודל והנגישות של עוברי עכברים מייצגים מגבלות משמעותיות עבור הדמית חיה של תהליכי שלד. דגים teleost קטנים, ומצד שני, לשמש חלופה אטרקטיבית הדמיה in vivo. דג זברה (Danio rerio) ו medaka (Oryzias latipes) הפכו במודלים של בעלי חיים פופולריים למחקר שלד במהלך שני העשורים האחרונים 17, 19, 22, 24. עצם חוליות דגים ביונקים דומה מאוד, הוא על מבני ברמה פיזיולוגית, ורבי גני רגולטוריים מפתח מסלולי איתות שמורים 3. כמו יונקים, דגים teleost בזהירות להסדיר את הפעילות של אוסטאובלסטים ו osteoclasts לאזן היווצרות העצם ספיגת 26. והחשוב מכל, הבהירות האופטית של fish זחלים מאפשרים שימוש כתבי ניאון לתייג תאי עצם ומטריצת השלד המסוידת 8, 9, 12, 21, 23, המאפשרת התצפית של תהליכים תאיים בתוך החי. בנוסף, שורה של כלים גנטיים נוצרה כדי להקל על מחקר biomedically רלוונטי בדגים. לקבלת medaka בפרט, שיטות מוטצית גן ממוקדת על ידי CrispR / Cas9 2, תא שושלת התחקות 6, ואתר ספציפי transgenesis 14 הוקם לאחרונה וכעת הם נרחב בשימוש 15. זחלי חוליות קטנים שמשו בהצלחה עבור מסכים כימי, אשר הוביל לגילוי של מספר תרופות רלוונטיות פרמקולוגית 1, 18. הזחלים דג סובלניים לריכוזים נמוכים של DMSO והם מסוגלים לספוג תרכובות מן הסביבה המימית שלהם, או דרך העור או דרך מערכת העיכול 1, 5. נציג המעבדה שלנו בעברקווי medaka מהונדסים orted מבטאי כתבי ניאון בתאי עצם בשליטת osteoblast- השונה ומקדמים ספציפיים osteoclast. אלה כוללים אוסטאובלסטים מוקדמים (קולגן 10a1, col10a1; osterix, OSX) 20, 21, אוסטאובלסטים בוגר (osteocalcin, OSC) 27, ו osteoclasts (cathepsin K, ctsk) 24. כמו כן, אנו שנוצרנו קו מהונדס המבטא את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של מקדם הלם-מושרה חום 24. אינדוקציה של RANKL במערכת זו התוצאה היא ההיווצרות אקטופי של osteoclasts הפעיל. זה מוביל ספיגת עצם מוגברת פנוטיפ אוסטאופורוזיס דמוי חמור, עם מינרליזציה באופן דרסטי בגופים בחוליות. הראינו לאחרונה כי פעילות האוסטאוקלסטים במודל זה יכול להיחסם על ידי etidronate ביספוספונטים ו alendronate, TWתרופות o נפוצות בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם, ובכך אימות medaka כמערכת מודל מתאימה אוסטאופורוזיס 27. בשל גדליו הגוזלים הגדולים שלהם, התפתחות מהירה, וגודל קטן של עוברים, זחלי medaka מהונדסים מתאימים בצורה ייחודית להקרנה בקנה המידה הגדולה של תרופות לאוסטאופורוזיס לניתוח vivo של התנהגות תא עצם. עיוני medaka ובכך יכולים להשלים ניסויים ביעילות בתרביות תאים והן בעכברים ומיועדים לגלות מטרות טיפוליות חדשות טיפולים חדשניים להפרעות עצמות אדם. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לטיפול זחלי medaka עצם כתב עם התרופה לאוסטאופורוזיס המשותפת, alendronate. כמו כן, אנו מתארים בפירוט כיצד מטופלים הזחלים הם רכובים והוכנו הדמיה חיה של מטריקס העצם תאי עצם. ניתן פרוטוקולים אלה להתאים בקלות תרכובות כימיות קטנות אחרות כי גם לעבוד אנבוליים עצם או תרופות תרופתיות. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Alendronate&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A4978</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:249px;">ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ImageJ (1.4.3.67)</td>
			<td style="width:177px;">National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM 510 Meta confocal&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">LSM Image Browser (4.2.0.121)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-loader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">NIS-Elements BR 3.0 software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:249px;">SMZ1000 stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

עצם יוצרי אוסטאובלסטים אינטראקציה עם osteoclasts-resorbing עצם לתאם את המחזור של מטריקס העצם לשלוט הומאוסטזיס שלד. Medaka וזחלי דג זברה נמצאים בשימוש נרחב כדי לנתח את ההתנהגות של תאי עצם במהלך היווצרות, ניוון עצם, ותיקון. הבהירות האופטית שלהם מאפשרת ההדמיה של תאי עצם צבעי ניאון שכותרתו fluorescently כבול מטריצת שלד mineralized. המעבדה שלנו יצרה דגי medaka המהונדס המבטאים את הגורם וישכנע osteoclast קולטן Activator של גרעיני-גורם κB ליגנד (RANKL) תחת השליטה של ​​מקדם הלם-מושרה חום. ביטוי אקטופי של תוצאות RANKL להיווצרות העודפת של osteoclasts מופעל, אשר ניתן דמיין בקווים הכתב עם ביטוי nlGFP תחת השליטה של אמרגן cathepsin K (ctsk). אינדוקצית RANKL והיווצרות osteoclast אקטופי מובילה פנוטיפים אוסטאופורוזיס דמוי חמורים. li medaka מהונדס מתחםנס מבטאי ctsk: nlGFP ב osteoclasts, כמו גם mCherry תחת השליטה של אמרגן osterix (OSX) ב אוסטאובלסטים מוקדמת, יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה של שני סוגי התאים. זה מקל על התצפית in vivo של התנהגות הסלולר בתנאים של ניוון העצם ואת החלמתה. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת זו כדי לבדוק תרופה המשמשת בדרך כלל בטיפול באוסטיאופורוזיס אדם מתאר פרוטוקול הדמיה לחיות. מודל medaka מוסיף למחקרים בתרבות תא ועכברים, ומציע מערכת חדשה לניתוח vivo של פעולת תרופה במערכת השלד.

מספרי ביצה שופעים, כמו גם את הגודל הקטן של הזחלים, להפוך medaka מודל מצוין הקרנת סמים. צלחת אחת שש גם שמשה לתרבות עד 36 זחלים, אשר היו מספיק כדי לספק נתונים בעלי משמעות סטטיסטית. יתרון גדול נוסף של שימוש דג לניתוח שלד הוא האפשרות לעשות הדמיה לחיות. השקיפות של זחלים דגים מאפש...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model at JoVE.com

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

The overall goals of this procedure are to use the embryos of transgenic Medaka bone reporter lines for drug testing and for live imaging of bone-cell behavior after the induction of osteoporosis like conditions. This method can help answer key questions in skeletal research such as how do different type of bone cells interact with each other in vivo? The main advantage of this technique is that the optical clarity of Medaka larvae allows live imaging of bone-cell behavior in an intact specimen.The implications of this technique extends towards the development of novel therapeutics for common bone diseases as it allows the visualization of long term effects of drug treatment in C2.All procedures described in this video were approved by IACUC of the National University of Singapore. To harvest the embryos during the first few hours of the light cycle, first use a fine meshed net to capture female adults carrying an egg cluster. Let the fish briefly rest in the net, and then gently massage the fish's abdomen to carefully strip the fertilized egg cluster from the abdomen of the female.Transfer 20 to 30 eggs into individual plastic 60 millimeter petri dishes, and use a plastic pipette to rinse the embryos in each plate with 5 to 10 milliliters of daneous solution. Gently roll egg cluster to form a knot of attachment filaments. Using forceps, carefully remove the attachment filaments from the fertilized egg clusters to obtain individual embryos.Then, culture the embryos in a 28 degrees Celsius incubator with daily medium changes to ensure normal embryonic development. For transgenic embryo screening, at two days post fertilization or later, heat shock the larvae for 20 minutes at 39 degrees Celsius. Then, use a stereo microscope equipped with a mercury lamp for fluorescence imaging to identify ubiquitous CFP expression.On day 5 post fertilization, mCherry reporter expression can be observed in osteoblasts of the early forming cranial bones on both sides of the posterior head and at a central position in the ventral cranium. Starting from day 6 post fertilization, robust nlGFP expression can be visualized in cathepsin positive cells of the head and tail. For the induction of an osteoporosis-like phenotype, subject the embryos to a 1.5 to 2 hour heat shock treatment at 9 days post fertilization or later to induce large numbers of ectopic osteoclasts in the trunk region.For bisphosphonate treatment, first transfer 6 Medaka larvae per well into a 6-well plate. Then use a clean, plastic pipette to carefully remove the fish medium. Add approximately 0.5 milliliters of bisphosphonate to each well to dilute any traces of medium.Then replace the wash solution with 4 milliliters of fresh bisphosphonate solution, and return the larvae to the incubator with daily medium changes for 2 to 6 days. At the appropriate experimental time point, filter freshly prepared bone staining solution through a single use 0.2 micron strainer. And incubate the larvae in a 1 and 10 dilution of the stain in fresh fish medium, for the appropriate staining period in a 28 degree Celsius incubator in the dark.At the end of the incubation, use a clean plastic pipette to transfer the larvae into fresh fish medium, and replace the stain contaminated medium with another aliquot of fresh medium. When there is no visible stain left in the medium, allow the larvae to rest in the fish medium for 30 to 60 minutes before imaging. For live fluorescence imaging of the Medaka larvae, use a plastic microloader to orient the anesthetized larvae according to the region of interest.And place them under a stereo microscope with fluorescence illumination. Select the appropriate magnification and image individual sections of each larvae using a suitable image processing software to stitch together the images at the appropriate overlapping regions. After each larvae has been imaged, return the animal to its well in the 6-well plate in fresh fish medium for recovery.For live confocal imaging, add 0.5 to 1 milliliter of 30 degree Celsius 1.5%liquid low melting agarose in fish medium to a glass bottom petri dish. Before the agarose solidifies, transfer an anesthetized larvae to the agarose and use a plastic microloader to push the larvae to the bottom of the dish. And use the yoke extension to orient the larvae according to the region of interest.After the agar has solidified, image the larvae by confocal microscopy. Then, use a pair of fine syringe needles to release the larvae from the agarose. And transfer each larvae and residually attached agarose into a new petri dish containing fresh fish medium for recovery.In these images, triple transgenic larvae were used for the simultaneous detection of premature osteoblasts and differentiated osteoclasts. Overview images were taken with a stereo microscope, while confocal microscopy was used to visualize processes at the cellular level. ALC stained bone matrix along the neural arches and sentry, was used as a reference for determining the position of the fluorescently labeled bone cells.RankL induction resulted in extensive formation of ectopic osteoclasts around the vertebral bodies. These excessive osteoclasts cause an osteoporosis-like phenotype which are observed as cavities in the mineralized centra, and as absent mineralization in the neural arches. After incubation in alendronate, osteoclasts formed normally but vertebral columns are intact, with no lesions and fully mineralized arches suggesting an efficient inhibition of osteoclast activity.Further, successive staining of the bone matrix with ALC followed by calcein, reveals a de novo mineralized bone matrix, with a simultaneous visualization of the osteoclasts and osteoblasts in the same intact larvae. Once mastered, this technique can be completed in 3 days from the induction of the osteoporotic lesions, until the imaging of the drug effect if it is performed properly. While attempting this procedure, it is important to remember to handle the living larvae with extreme care and to mound the larvae properly so that the region of interest will be in one focal plane.Following this procedure, other methods like noninvasive sulfate checking of individual bone precursor sites can be performed to answer additional questions such as bone-cell origin, activation, and attraction to the lesion sites for subsequent bone repair. After the development of this technique, it pave the way for scientists in the field of bone research to explore the effects of various chemical compounds, or genetic mutations on the dynamic behavior of cells during bone homeostasis. After watching this video, you should now have a good understanding of how to use Medaka bone transgenic lines for drug screening and live imaging of bone-cell behavior.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...