Name: collection of serum- and feeder-free mouse embryonic stem cell-conditioned medium for a cell-free approach
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00
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Diese Forschung wurde von der Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) und dem Medical Research Center-Programm (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung. Diese Forschung wird auch von einem Start-up Betriebskostenzuschuss der Hospital for Sick Children (HK Sung) unterstützt. Wir möchten, dass Laura Barwell und Sarah JS Kim für ihre hervorragende Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts und Dr. Andras Nagy für die Bereitstellung der G4 MESC Linie zu danken.

HINWEIS: Ein Schema des serum- und feeder freien CM Sammelprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Materialien (Herstellung von MEF, Medium, Platten, und Lösungen) <ol><li> Bereiten Sie 500 ml Medium zur Kultur der MEFs. Ergänzung nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS (ESC-Qualität), 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin. </li><li> Isolieren MEFs von Embryonen nach einer etablierten Routine - Protokoll 13 und halten sie in MEF Medium. ...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Lavasani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-derived+stem/progenitor+cell+dysfunction+limits+healthspan+and+lifespan+in+a+murine+progeria+model.">Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.</a> Nat Commun. 3, 608 (2012).</li><li>Woo, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy.">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153, 828-839 (2013).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li><li>Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisenescence+effect+of+mouse+embryonic+stem+cell+conditioned+medium+through+a+PDGF/FGF+pathway.">Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway.</a> FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation.">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).</li><li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+enrichment+and+analysis:+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS/MS.">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li><li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers.">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cellular+senescence+by+insulin-like+growth+factor+binding+protein-5+through+a+p53-dependent+mechanism.">Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism.</a> Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).</li><li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells.">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).</li></ol>

Für die erfolgreiche Sammlung von Serum- und Feederfreien MESC-CM, sollten die folgenden Vorschläge in Betracht gezogen werden. Der wichtigste Faktor ist für die Sammlung von MESC-CM frühen Passage mESCs verwenden. Bisher hat es sich gezeigt, dass eine frühe Passage MESC-CM bessere Anti-Aging-Effekte im Vergleich zu späten Passage mESCs hat. Die Passage Anzahl von mESCs wurde berichtet, ihr Entwicklungspotenzial 16 und Pluripotenz 17 zu beeinflussen. Während weit...

Das Ziel dieses Protokolls ist embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM) von serum- und Feeder-freien Kulturbedingungen zu sammeln und ihre biologischen Funktionen zu charakterisieren. Im Allgemeinen haben embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) ein großes Potential für die regenerative Medizin und Zelltherapie aufgrund ihrer Pluripotenz und Fähigkeit zur Selbsterneuerung 1-3. Jedoch hat die direkte Transplantation von Stammzellen mehrere Einschränkungen, wie Immunabstoßung und Tumorbildung 4,5. Daher kann ein zellfreier Ansatz eine alternative therapeutische Strategie für die regenerative Medizin zur Verfügung stellen und Alterungs Interventionen 6,7. Seneszenz wird als ein zelluläres Pendant zur Alterung von Geweben und Organen betrachtet, von einem permanenten Zustand der Wachstumsarrest, veränderte Zellphysiologie und Verhalten charakterisiert. Altern ist der Hauptrisikofaktor für weit verbreitete Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf- Erkrankungen, typ - 2 - Diabetes und neurodegenerative Krankheit 8. Einer der offensichtlichen Merkmale des Alterns ist der Rückgang der regenerative Potenzial von Geweben, die durch Stammzellalterung und Erschöpfung 9 verursacht wird. Viele Studien haben signifikante pharmakologische Moleküle gezeigt, wie Rapamycin 9, Resveratrol 10 und Metformin 11 und hämatogenen systemische Faktoren, nämlich GDF11 12, die die Fähigkeit haben konsequent Alterung verzögern und die Lebensdauer verlängern. In der vorliegenden Studie wurde MESC-CM wurde ohne Serum (fötales Rinderserum, FBS) und feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -Schichten geerntet, um die Kontamination von Serumfaktoren und sekretorischen Faktoren von MEFs auszuschließen. Diese Bedingungen erlaubt eine serum-und Feeder-freie CM, die folglich die genaue Identifizierung von MESC spezifischen sekretorischen Faktoren aktiviert. Diese vorgeschlagene Protokoll ist sehr leistungsfähig, relativ kostengünstig und einfachzu bedienen. Diese Technik liefert einen Einblick in die Charakterisierung von MESC abgeleiteten löslichen Faktoren, die eine anti-Seneszenz Wirkung vermitteln kann, die für die Entwicklung eines sicheren und potenziell vorteilhaft zellfreien therapeutischen Ansatz zur Interventionen für alterungs assoziierten Krankheiten und andere regenerative verwendet werden kann, Behandlungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">DMEM</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:64px;">#11960-044</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:64px;">FBS</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:64px;">#30044333</td>
			<td style="width:64px;">20%, ES cell quality</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="148" rowspan="2" style="height:148px;width:64px;">Penicillin and streptomycin&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">#15140</td>
			<td style="width:64px;">50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">-mycin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:64px;">#25030</td>
			<td style="width:64px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Nonessential amino acids (NEAA)&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:64px;">#11140</td>
			<td style="width:64px;">100uM</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:64px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">#M3148</td>
			<td style="width:64px;">100uM</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Leukemia inhibitory factor&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:64px;">#ESG1107</td>
			<td style="width:64px;">100units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">OPTI-MEM</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:64px;">#22600</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">X-gal&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">#B4252</td>
			<td style="width:64px;">1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:64px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">P6148</td>
			<td style="width:64px;">3.70%</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:64px;">Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">#D4551</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Potassium ferricyanide&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Aldrich</td>
			<td style="width:64px;">#455946</td>
			<td style="width:64px;">5mM</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">potassium ferrocyanide&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Aldrich</td>
			<td style="width:64px;">#455989</td>
			<td style="width:64px;">5mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">#S7653</td>
			<td style="width:64px;">150mM</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:64px;">MgCl2&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">#M2393</td>
			<td style="width:64px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">Mytomycin C&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">#M4287</td>
			<td style="width:64px;">10ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">#P4170</td>
			<td style="width:64px;">50ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">TRIzol</td>
			<td style="width:64px;">Ambion</td>
			<td style="width:64px;">#15596018</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">M-MLV reverse transcript-tase</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:64px;">#M170B</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">Power SYBR Green PCR master mix&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:64px;">#4367659</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast&#160;</td>
			<td style="width:64px;">LONZA</td>
			<td style="width:64px;">#CC-2511</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">Bottle top filter,&#160;</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:64px;">#430513</td>
			<td style="width:64px;">0.2&#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of serum- and feeder-free mouse embryonic stem cell-conditioned medium for a cell-free approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Ursprünglich mESCs sind auf einem MEF Feeder in MESC Medium mit FBS und andere Ergänzungen (1A und 2A) gehalten. CM wurde von mESCs in der verkleinerten Serum Medien ohne Feeder - Schicht, FBS oder andere Ergänzungen (1B und 2B) gesammelt. Diese Kulturbedingungen ermöglicht es uns, MESC spezifische konditionierte Medium ohne eine mögliche Kontamination durch die Faktoren aus dem Einzug, FBS oder andere Ergänzungen ...

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Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Gewinnung von embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM), abgeleitet von Serum (fötales Rinderserum, FBS) - und Feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -freien Bedingungen für eine Zelle -freie Ansatz. Es kann für die Behandlung von Hautalterung und Alterungs-assoziierten Erkrankungen Anwendung finden.

Sammlung von Serum- und Feeder-freie Maus embryonale Zellen konditionierten Medium für eine zellfreie Ansatz Stem

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...