Name: spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast
Uploaded: 2017-02-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast at JoVE.com

This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

1. Приготовление образца <ol><li> Grow дрожжевые клетки деления , выражающие полюс шпинделя тела маркер SAD1-mCherry 23 и типа II регуляторной легкой цепи миозина Rlc1-томат 24 в YE жидких средах при температуре 32 ° С в течение 8 поколений. Примечание: Для чувствительных к те?...

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+cytokinesis+in+eukaryotes.">Mechanics of cytokinesis in eukaryotes.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).</li><li>Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+eukaryotes.">Cytokinesis in eukaryotes.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).</li><li>Xu, X., Vogel, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+promotes+cleavage+furrow+maturation+during+cytokinesis.">A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis.</a> Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).</li><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+and+cancer.">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).</li><li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells.">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+development+and+disease:+variations+on+a+common+theme.">Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme.</a> Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).</li><li>Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+cytokinesis+in+cells+deficient+in+the+breast+cancer+susceptibility+protein+BRCA2.">Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2.</a> Science. 306 (5697), 876-879 (2004).</li><li>Storchova, Z., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+polyploidy+to+aneuploidy,+genome+instability+and+cancer.">From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).</li><li>Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile-ring+assembly+in+fission+yeast+cytokinesis:+Recent+advances+and+new+perspectives.">Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).</li><li>Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+cytokinesis+in+budding+yeast,+fission+yeast+and+animal+cells.">Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells.</a> Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).</li><li>Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+turgor+pressure,+the+contractile+ring,+and+septum+assembly+to+forces+in+cytokinesis+in+fission+yeast.">Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast.</a> Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+cell+wall+beta(1,3)glucan+is+required+to+couple+septation+to+actomyosin+ring+contraction.">Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction.</a> J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).</li><li>Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+TRAPP-II+Complex+and+the+Exocyst+in+Membrane+Deposition+during+Fission+Yeast+Cytokinesis.">Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis.</a> PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).</li><li>Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drc1p/Cps1p,+a+1,3-beta-glucan+synthase+subunit,+is+essential+for+division+septum+assembly+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+(1,3)beta-D-glucan+synthase+subunit+Bgs1p+is+responsible+for+the+fission+yeast+primary+septum+formation.">The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation.</a> Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).</li><li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+Paxillin-like+Protein+Pxl1+and+Glucan+Synthase+Bgs1+Is+Essential+for+Actomyosin+Ring+Stability+and+Septum+Formation+in+Fission+Yeast.">Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast.</a> PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).</li><li>Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+(1,3)beta-D-glucan+synthase+catalytic+subunit+homologue+Bgs1p/Cps1p+from+fission+yeast+suggests+that+it+is+involved+in+septation,+polarized+growth,+mating,+spore+wall+formation+and+spore+germination.">Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination.</a> J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).</li><li>Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+the+integral+membrane+protein+Cps1p+to+the+cell+division+site+is+dependent+on+the+actomyosin+ring+and+the+septation-inducing+network+in+Schizosaccharomyces+pombe.">The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasma+membrane+flattens+out+to+fuel+cell-surface+growth+during+Drosophila+cellularization.">The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).</li><li>Wei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Spatiotemporal+Activation+Pattern+of+Cdc42+by+Gef1+and+Scd1+Promotes+Different+Events+during+Cytokinesis.">Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. , (2016).</li><li>Nabeshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast:+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle.">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).</li><li>Johnson, A. E., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dma1+ubiquitinates+the+SIN+scaffold,+Sid4,+to+impede+the+mitotic+localization+of+Plo1+kinase.">Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase.</a> EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).</li><li>Yonetani, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cytokinesis+by+the+formin+cdc12p.">Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p.</a> Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).</li><li>Hachet, O., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1p/anillin+and+the+septation+initiation+network+orchestrate+contractile+ring+assembly+for+cytokinesis.">Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis.</a> Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+ring+coordinates+curvature-dependent+septum+assembly+during+fission+yeast+cytokinesis.">The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-level+investigation+of+the+structure,+transformation,+and+bioactivity+of+single+living+fission+yeast+cells+by+time-+and+space-resolved+Raman+spectroscopy.">Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy.</a> Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).</li><li>Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

Здесь мы описали протокол для изучения cytokinetic событий в делящихся дрожжей во временном порядке. Протокол, описанный здесь, обеспечивает временное разрешение различных событий cytokinetic со ссылкой друг к другу; сроки набора белков или потери со ссылкой на cytokinetic фазе; Структура кольца на пр...

Цитокинез, заключительный шаг в клеточном делении, является сложным процессом, необходимым для правильной дифференциации, развития и выживания организма. Цитокинез включает в себя множество событий, которые организованы , чтобы обеспечить успешное разделение клеток при сохранении целостности геномную 1. Цитокинез включает в себя события , где актомиозиновый кольцо после сборки претерпевает перетяжку, которая одновременно с расширением мембраны и бороздование, и внеклеточной клеточной ремоделирование матрикса, наконец , с последующей клеточной опадение 1, 2, 3. Неправильная организация cytokinetic событий может привести к разделению клеток и плоидности дефектов, а также может вызвать такие заболевания , как рак 4, 5, 6, 7, 8. Основные принципы, которые дают возможность выводаРГАНИЗАЦИЯ из cytokinetic событий не вполне понятны, что приводит к блокпостов в нашем понимании этиологии этих заболеваний. Делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) является отличной моделью системы для изучения цитокинеза из - за сохраняющегося природы белков , участвующих 1. В делящихся дрожжей, после того, как актомиозинового кольцо в сборе, кольцо входит в / задержки фазы созревания , где она не сужают 9. Созревание заканчивается с началом актомиозиновый кольца перетяжки, одновременно с мембраной бороздить и перегородку ингрессии. Семенной работа на протяжении многих лет дали нам достаточно хорошее понимание актомиозинового кольца сборки при делении дрожжей 1, 9, 10. В некоторых эукариот, в том числе делящихся дрожжей, успешная сборка актомиозинового кольца не является достаточным для мембранного бороздование. В Fission дрожжи, кольцо Сужение само по себе не обеспечивает достаточной силы , чтобы преодолеть внутреннее давление тургора для формирования борозды 11. Недавно модель указывает на то, что эта сила вместо этого обеспечивается перегородке ингрессии 11. В другой модели, роль расширения плазматической мембраны было предложено внести свой вклад в борозду образование 12, 13. Кольцо Сужение и мембраны бороздование не происходит в температурном Bgs1 / CPS1 чувствительной мутантной cps1-191, основного фермента для формирования первичной перегородки 14, 15. Клетки , лишенные Bgs1 показывают дефектный первичный перегородку и длительное кольцо перетяжку 15, 16. Bgs1 набирается на сайт клеточного деления для перегородке вхождени во время созревания после актомиозинового кольца в сборе 17, 18. Similarlу, во время cellularization у дрозофилы эмбрионов, кольцо Сужение двухфазный со значительно медленной начальной скорости 19 стягивания, напоминающим фазу созревания наблюдается у делящихся дрожжей. Двухфазный кольцо Сужение может замедлить мембраны бороздят , чтобы обеспечить достаточное расширение мембраны 20 и модификации внеклеточного матрикса. Это говорит о том, что после того, как актомиозинового кольцо в сборе, кольцо Сужение эффективно происходит только тогда, когда клетка удовлетворяет требованиям, предъявляемым к бороздам формирования. Это не очень хорошо понимал, какие условия необходимы для актомиозиновый кольцевого сужения после сборки кольца, ни молекулярных событий, которые регулируют этот процесс. Недавно мы показали , что после актомиозина кольцо сборка маленький GTPase Cdc42 подвергается уникальной пространственно - временной паттерн активации 21. Эта модель устанавливается уникальным рисунком локализации Cdc42 факторов обмена гуанидин (нуклеотидныхGEFs), которые активируют Cdc42. Gef1 ГЭФ локализуется в собранном актомиозинового кольце и способствует начало кольца сужением и перегородку ингрессии, в то время как scd1 локализуется в бороздить мембраны и способствует нормальному формированию перегородки. Мы находим, что картина активации Cdc42 устанавливается его GEFs приводят к регуляции различных cytokinetic событий. Для того, чтобы понять молекулярный механизм событий, которые в конечном итоге приводят к разделению клеток после актомиозиновый кольца в сборе, необходимо следовать различные cytokinetic события во времени и пространстве. В делящихся дрожжей, цитокинез первая включает в себя сборку узлов-предшественников вокруг ядра, которые в конечном итоге вербуют миозина II типа, в Formin Cdc12, а также другие белки, необходимые для сборки актомиозиновый кольца. Для того, чтобы время различные cytokinetic события и обеспечить систему отсчета, разделение шпинделя полюса маркеров тела (формирование шпинделя) считается время 0 22. Сборка-гое актомиозиновый кольцо может сопровождаться мониторинг с течением времени интенсивность флуоресцентно меченый актомиозиновом кольцевого белка, таких как тип II регуляторной легкой цепи миозина Rlc1. Здесь мы опишем микроскопический подход для анализа различных этапов цитокинезе с течением времени.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract media</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>YES 225</td>
			<td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SeaKem LE agarose, Lonza</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottomed culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td>
			<td>Visitech International, UK</td>
			<td></td>
			<td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

Цитокинез, заключительный шаг в делении клеток имеет решающее значение для поддержания целостности генома. Правильное цитокинез имеет важное значение для дифференцировки и развития клеток. Цитокинез включает в себя ряд мероприятий, которые хорошо скоординированные во времени и пространстве. Цитокинез предполагает формирование актомиозинового кольца на участке разделения, а затем кольцевой сужением, формирование мембраны по бороздам и внеклеточной матрицы ремоделирования. Делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) является хорошо изученным модель системы, которая раскрывается с существенной ясности начальные события в цитокинезе. Тем не менее, мы не понимаем ясно, каким образом различные cytokinetic мероприятия координируются spatiotemporally. Чтобы определить это, необходимо проанализировать различные cytokinetic события в больших деталях и во времени и в пространстве. Здесь мы опишем подход микроскопии для изучения различных cytokinetic эвЭнты в живых клетках. При таком подходе можно время разные cytokinetic события и определить время набора различных белков во время цитокинеза. Кроме того, мы описываем протоколы для сравнения локализацию белка и распределение на месте клеточного деления. Это базовый протокол для изучения цитокинез в делящихся дрожжей, а также могут быть использованы для других дрожжевых и грибковых систем.

Деление дрожжевые клетки , экспрессирующие маркер кольцо, Rlc1-GFP (зеленый, рисунок 2) и шпиндель маркер полюса тела SAD1-mCherry (красный, рисунок 2) во время цитокинеза были обследованы. Наступление шпинделя маркера полюса тела (белая стрелка, рисунке 2а, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast at JoVE.com

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces pombe является прекрасной модельной системой для изучения цитокинез, заключительный этап клеточного деления. Здесь мы опишем подход микроскопии для анализа различных cytokinetic событий в делящихся дрожжей живых клеток.

Пространственно-временная Анализ Cytokinetic События в делящихся дрожжей

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

The overall goal of this live cell microscopy technique is to study to the spatiotemporal events that occur during cytokinesis in the fission yeast model system. This method can help answer key questions in the cytokinetic field such as the molecular details of the different stages of cytokinesis over time. The main advantage of this technique is that different spatial components of the cytokinetic machinery can be analyzed over long periods of time with minimal toxicity to the cells.Though this method can provide insight into cytokinesis and fission yeast, it can also be applied to budding yeast and other fungi. To begin this procedure, pour three to four milliliters of melted media laced with Vitamin C onto a glass-bottomed culture dish. Once the media has solidified, use a sharp scalpel to gently raise the media slab from the culture dish, and place a pipette tip between the media slab and the culture dish to prevent the slab from falling back into the dish.Next load two to five microliters of re-suspended cell culture between the media slab and the glass bottom of the culture dish. Then very gently remove the pipette tip and place the media slab back in its original position on the culture dish. Incubate the cells in the culture dish for 30 minutes to an hour in the dark at the temperature the microscopy will be performed.When the cells are ready for imaging, place a drop of wild on the outer side of the glass on the culture dish. Place the culture dish on an inverted microscope. Focus on the medial plane of the cells, and ensure that they are well-spaced and not too crowded.Make sure to start image acquisition of the cells in a suitable stage of the cell cycle. In this experiment, it is late G2.Next, program the image acquisition software. Set the exposure time for DIC to 100 milliseconds.For GFP and RFP filters, use exposure times of 75 milliseconds. Set the laser power to 50%but note that this will vary depending upon the individual experiment. To capture images in three dimensions, program the software to acquire Z series.Use of a maximum step size of 4 micrometers and a distance of 3.0 micrometers around the central focus point of the cells for the capture of 16 Z frames per time point for the total Z distance of 6 micrometers. These parameters can be altered in accordance with the thickness of the cell. Set the program to take images every two minutes.Select the exposure time based on the requirements of the experiment. In this example, 75 milliseconds is used. Program the software to stop acquisition after 90 minutes.And then start the image acquisition. ImageJ software is used to analyze the image. To begin, open the image series for each of the wavelengths.Select a cell to be studied. Double click on the line option of the toolbar to open another window to adjust the line width. Adjust the line width to correspond to the cell width which is about 40 to 50 pixels for a wild type cell.Draw a line along the long axis of the cell of interest. Click on analyze then tools then ROI manager and then click on add. This will add the selected line to the ROI window for later use.Do not close this window. Click on the image of interest then select edit, then selection, then straighten. Check process entire stack to straighten the cell horizontally.Click on image then transform then rotate 90 degrees right to straighten the image vertically. Click on image then stacks then make montage. This will open a window for assigning the number of rows and columns for the stack, the scale factor for the image size, the first and last slice or frame for the montage, and the frame increment for the montage.Check label slices and hit enter. As a window with a montage of the cell of interest is shown, open the image series for the other wavelength. In the ROI manager, click on the line identifier to select the same cell on the second image file.Repeat the previous steps to open a montage of the second image. On the image with the spindle pole body marker, Sad1-mCherry, look for the separation of the spindle pole body marker, and mark that time point as time zero. Follow the signal of the ring protein Rlc1-tomato on the image over time, and look for the signal that appears as a distinct line as opposed to the patches of Rlc1-tomato.This time point marks completion of actomyosin ring assembly or the start of the maturation phase. Next scroll through the movie over time to determine when the Rlc1-tomato ring starts to decrease in size. This is marked as the end of maturation phase or onset of ring constriction.Follow the Rlc1-tomato signal over time throughout constriction until it appears as a dot in the middle of the cell axis. This is marked as the end of ring constriction or end of septum ingression. Following the montage of DIC images, determine when abscission is completed.Record the time point when the cells physically separate. Begin this analysis by selecting a cell with a visible actomyosin ring. Double click on the line option of the ImageJ toolbar.Adjust the line width to correspond to the ring thickness about 15 to 20 pixels. Draw a line along the ring, taking care to ensure the entire thickness of the ring is included. Click on analyze, then tools, then ROI Manager, and click on add.This will add the select line to the ROI window for later use. Do not close this window. Click on the image of interest and select edit, then selection, then straighten.Check process entire stack to straighten the ring horizontally. Reset the intensity of the brightest plane in the straighten Z stack using image, then adjust, then brightness and contrast, then reset. Click on the tab SGK then 3D project to open a dialogue box.Change the projection method to brightest point and slice spacing to two to three pixels. Finally, change the axis of rotation to X or Y-axis depending upon the desired viewing angle. Click interpolate and click OK to generate a 3D projection of the image.Use the scroll bar beneath the image to rotate the image. Next, open the image series for the other wavelength. Click on the line identifier in the ROI manager to select the same ring on the second image file.Repeat the previous steps to open a 3D ring in the image with the other wavelength. With both 3D image rings open, click on image, then color, then merge channels. Select each image from the dropdown menu for the corresponding color desired and click OK.Compare the localization of different markers with regards to the localization at the cytokinetic ring or ingressing membrane.Fission yeast cells expressed in the spindle pole body marker, Sad1-mCherry and ring marker Rlc1-GFP were imaged during cytokinesis. Spindle pole body separation occurred at 17 minutes, designated as time zero. Rlc1-GFP appears at the division site four minutes before spindle pole body separation.After spindle pole body separation, ring maturation starts at ten minutes. Ring constriction begins at 31 minutes, and ends at 53 minutes. Finally, cell abscission occurs at 80 minutes after spindle pole body separation.The timeline of cytokinetic events determined in the previous images can be plotted in a graph with reference to mitosis as determined by the distance between the spindle pole body markers. Analysis of the ring marker Rlc1-tomato and the septum membrane marker Bgs1-GFP at the division site throughout cytokinesis reveal that the ring assembled before Bgs1-GFP recruitment. As the ring constricts, Bgs1-GFP also localizes to the ingressing membrane adjacent to the constricting ring.Finally, Rlc1-tomato signal dissipates after ring constriction while Bgs1-GFP appears as a disk, remaining within the membrane barrier. The efficiency of cytokinetic events can be determined by the distribution of proteins along the ring. Here Cdc15-GFP distribution along the ring is even on the left image but uneven on the right image.Once mastered, this technique can be done in two to three hours if performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to choose cells with an appropriate field, ideally containing six to eight well-spaced cells in late G2 or early M phase, with no visible impurities in the agar. After watching this video, you should have a good understanding of how to spatiotemporally analyze protein localization during cytokinesis.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Диапазона измерений репликативной Жизнь в почкующихся дрожжей

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Анализ развития Морфологические Фенотип как функция концентрации белка в почкующихся дрожжей

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Живых изображений сотовый событий раннего этапа Аутофагия: Omegasomes и на последующий период

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Пространственно-временная Отображение подвижности в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подготовка кишечника

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Микроскопия делящихся дрожжей Жизненный цикл сексуальной

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Применение pHluorin для количественного, Kinetic и высокой пропускной способностью анализа эндоцитоза у почкующихся дрожжей

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Количественная оценка спатиотемпоральных параметров клеточного экзоцитоза в микропаттернальных клетках

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...