Name: loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction at JoVE.com

وقد أجري هذا البحث في إطار برنامج الحكومة الروسية للنمو التنافسي لجامعة كازان الاتحادية ومنحة من المؤسسة الروسية للبحوث الأساسية (16-04-01051؛ 16-34-00817؛ 15-04-02983). نشكر أربعة مراجعين مجهولين لتقديم تعليقات مفيدة على المسودات السابقة للمخطوطة. ونحن نعرب عن امتناننا ل يوليا أراتسكايا للتسجيل الصوتي. نحن ممتنون للدكتور فيكتور إليين على العديد من التعليقات المفيدة والمساعدة في تحرير النهائي للمخطوطة.

<ol>
	<li>Llin&#225;s, R., Sugimori, M., Silver, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+high+calcium+concentration+in+a+presynaptic+terminal.">Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal.</a> Science. 256, 677-679 (1992).</li><li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+calcium+trigger+neurotransmitter+release?.">How does calcium trigger neurotransmitter release?.</a> Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).</li><li>Burnashev, N., Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++dynamics,+Ca2++buffers+and+synaptic+efficacy.">Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy.</a> Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).</li><li>Schneggenburger, R., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+calcium+and+control+of+vesicle+fusion.">Presynaptic calcium and control of vesicle fusion.</a> Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).</li><li>Pang, Z. P., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+Ca2+-triggered+exocytosis.">Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).</li><li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+and+transmitter+release+in+a+fast+CNS+synapse.">Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse.</a> Nature. 383, 431-434 (1996).</li><li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+during+a+single+action+potential+in+a+large+presynaptic+terminal+of+the+rat+brainstem.">Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem.</a> J Physiol. 506, 143-157 (1998).</li><li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses.">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).</li><li>Molg&#243;, J., Mallart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Anemonia+sulcatatoxin+II+on+presynaptic+currents+and+evoked+transmitter+release+at+neuromuscular+junctions+of+the+mouse.">Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse.</a> Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).</li><li>Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+feedback+inhibition+of+acetylcholine+release+in+frog+neuromuscular+junction.">Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).</li><li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+of+ion+concentrations.">Fluorescent indicators of ion concentrations.</a> Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+calcium+indicators+work.">How calcium indicators work.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).</li><li>DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+detection+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+transients+at+a+Xenopus+neuromuscular+junction.">Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction.</a> J Physiol. 505, 585-592 (1997).</li><li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+presynaptic+calcium+currents.">Optical measurement of presynaptic calcium currents.</a> Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).</li><li>Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+at+the+frog+motor+nerve+terminal.">Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal.</a> Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca2++ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-pixel+optical+fluctuation+analysis+of+calcium+channel+function+in+active+zones+of+motor+nerve+terminals.">Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).</li><li>Regehr, W. G., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+presynaptic+calcium+dynamics+with+membrane-permeant+indicators.">Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators.</a> Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. , 307-314 (2005).</li><li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+Application+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction.">Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).</li><li>Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+loading+with+Patch+Pipettes.">Dye loading with Patch Pipettes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).</li><li>Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsin+II+and+calcium+regulate+vesicle+docking+and+the+cross-talk+between+vesicle+pools+at+the+mouse+motor+terminals.">Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals.</a> J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).</li><li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Injection+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction.">Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).</li><li>Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dependence+of+damage+to+mouse+motor+nerve+terminals+following+oxygen/glucose+deprivation.">Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation.</a> Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).</li><li>Peng, Y. Y., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+LHRH+is+linearly+related+to+the+time+integral+of+presynaptic+Ca2++elevation+above+a+threshold+level+in+bullfrog+sympathetic+ganglia.">Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia.</a> Neuron. 10, 465-473 (1993).</li><li>Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Latrotoxin+releases+calcium+in+frog+motor+nerve+terminals.">alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).</li><li>Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+muscarine-induced+synaptic+depression+at+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction.</a> Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).</li><li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction.">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li><li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+activity+but+not+intracellular+calcium+determines+the+time+course+of+endocytosis+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li><li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse.">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li><li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+suction+electrode+for+electrical+stimulation+of+biological+objects.">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), 13-16 (2015).</li><li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction.">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li><li>B&#233;lair, E. L., Vall&#233;e, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs.">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li><li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes.">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li><li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraterminal+Ca2++and+spontaneous+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li><li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++from+one+or+two+channels+controls+fusion+of+a+single+vesicle+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li><li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom.">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li><li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+registration+in+response+to+single+stimulation+and+during+train+of+pulses+in+mouse+neuromuscular+junction.">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في هذه الورقة، قدمنا ​​طريقة أداء كا 2 + -حساسية صبغ تحميل في الضفدع النهايات العصبية من خلال الجذع العصب. وبحلول نهاية إجراء التحميل، وجميع المحطات في الجزء القريب من العصب لديهم مستويات كبيرة من مضان. وقد قدر أن تركيز داخل محطة من التحقيق يختلف بين 40 و 150 ميكرومتر 17 . يتم إجراء الحضانة في خطوتين: في درجة حرارة الغرفة ثم عند درجة حرارة أقل في الثلاجة. من المهم السيطرة على وقت حضانة الأنسجة مع الصبغة في درجة حرارة الغرفة. اعتمادا على الطول الفعلي للجذع العصب، صبغ معين، ودرجة الحرارة، قد تختلف فترة حضانة. إذا التعرض المفرط، والمحطات في الأجزاء القريبة على مقربة من الجذع العصب يمكن أن تكون مفرطة. ومع ذلك، في الجزء الأوسط من العصب، فإنه لا يزال من الممكن العثور على المحطات التي يتم تحميلها بشكل مرض. خلال ثه حضانة طويلة في الثلاجة، وتوزع الصبغة بالتساوي على النهايات العصبية. ملاحظاتنا الخاصة 33 ، 35 ، فضلا عن البيانات من الباحثين الآخرين 30 ، تثبت عدم وجود أي تأثير ملموس من إجراءات التحميل على اتساع استجابة ما بعد المشبكي أو على وتيرة إمكانيات لوحة نهاية مصغرة. تم توثيق العمر الجيد في التحضيرات المحملة. هناك بعض النقاط الهامة التي نود لفت الانتباه إليها. فمن الضروري جدا لوضع الجذع العصب في محلول صبغ تحميل في غضون دقائق بعد الاستئصال لتمكين الصبغة للدخول في محاور عصبية قطع. والتأخير يمكن أن يسبب التحميل غير فعالة، ويفترض بسبب إعادة ختم المحاور العصبية 27 ، 36 . بعض المحققين تزج الجذع العصبي في 100 ملي إدتا (كا 2+ - و مغ 2 + -chelator) مباشرة بعد استئصال العصب لمنع محاور قطع من ختم. تتم إزالة المخزن المؤقت بعد 1-2 دقيقة واستبداله محلول صبغ تحميل 37 . استخدام البتروليوم هلام جيدا بدلا من الأنابيب البلاستيكية لإجراء التحميل يسمح استخدام أقصر العصب الجذع. أثناء استخدام هذا النهج، يتم قطع العصب بعد مغمورة في الحل هيبيس مع صبغ، والمحاور عصبية لا تختتم بسبب عدم وجود أيونات ثنائي التكافؤ في محلول صبغ 27 ، 28 . في دراستنا، استخدمنا شكل الملح القابل للذوبان في الماء من مؤشر كا 2 + بدلا من ديكستران. ديكستران تقارن منتشر في محور عصبي أكثر ببطء من أشكال الملح. ومع ذلك، فإن استخدام مترافق ديكستران يقلل من صبغ المقصورة والمناولة من قبل العصب و نمجس. الكالسيوم الأخضر 1-3،000 ميغاواط ديكستران متقارن لديه معدل نشر جيد ويوضح انخفاض التقسيم <s<html> أوب كلاس = &quot;كريف&quot;&gt; 38. من المهم جدا لتجنب فترة طويلة من الإضاءة الفلورسنت من الأنسجة، لأن هذا يؤثر على صحتها والبقاء على قيد الحياة. نحن نستخدم البصريات نومارسكي في قناة الضوء المرئي للبحث عن محطات العصب. خلال التسجيل، ونحن نحد من حقل مضيئة باستخدام الحجاب الحاجز. ومن الجدير بالذكر أن طريقة التحميل هذه مناسبة فقط للاستعدادات التي يمكن أن تصمد أمام الحضانات الطويلة. لتقليل الوقت صبغ التحميل عندما تجري الدراسات على الأنسجة أكثر هشاشة (على سبيل المثال، نقاط الاشتباك العصبي من الحيوانات ذات الدم الحار)، فمن الضروري تقليص طول الجذع العصبي واستخدام ميكروبيبيتس لتحميل 29 ، 39 . تقنية التحميل هذه مناسبة تماما للتغيرات التصوير في كا 2 عصاري خلوي، مع مؤشرات الفلورسنت تحت كل من التحفيز العصب واحد والنشاط متشابك الإيقاعيإف &quot;&gt; 17 ، 27 ، 35. يمكن استخدام تحليل السعة الكالسيوم 2+ -transient لدراسة تأثير المواد المختلفة على دخول الكالسيوم الذي يشارك في الإفراج العصبي 33 .

أيونات الكالسيوم (كا 2 + ) المشاركة في العديد من عمليات الإشارات العصبية، بما في ذلك بدء والصيانة، والمرونة من إطلاق سراح 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . عند وصول إمكانات العمل، خارج الخلية كا 2 + يدخل محطة العصب ويبدأ الافراج العصبي. في بعض نقاط الاشتباك العصبي، يمكن قياس تيار الكالسيوم مباشرة بواسطة الطرق الكهربية 6 ، 7 ، 8 . في حالة تقاطع العصبية والعضلية (نمج)، لا يمكن للمرء أن استخدام المشبك التصحيح المباشر واثنين من القطب الكهربائي المشبك الجهد بسبب حجم دقيقة من النهايات العصبية. تسجيلات كا 2 الداخل + التيارات من النهايات العصبية في نمج يمكن أن يتم عن طريق إلكتروفيس غير مباشرةطرق إيولوجية 9 ، 10 . ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تتطلب المعالجة المسبقة من المشبك بواسطة الصوديوم والبوتاسيوم حاصرات قناة أيون. الطرق البصرية لا تتطلب الفصل الدوائي من التيارات الأيونية في محطة العصب وتسجيلات تسجيل كا 2 + تدفق، الناجمة عن إمكانات العمل، والارتفاع اللاحق من كا 2 + أيونات في الأكزوبلازم 11 ، 12 ، 13 ، 14 . وتستند هذه الأساليب على تسجيلات التغيرات في مضان محددة كا 2 + أصباغ حساسة على ملزمة خالية كا 2 + الأيونات 15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19 . كا 2+ مؤشرات يمكن تحميلها في جمن خلال مجموعة متنوعة من الأساليب، اعتمادا على الغرض من التجربة. يستخدم الباحثون تطبيق حمام من أشكال صبغ غشاء نفاذية 20 ، 21 ، تحميل عبر ماصة التصحيح 22 ، أو ميكروينجكتيون 23 ، 24 ، 25 . ومع ذلك، كل هذه الأساليب لديها بعض القيود في حالة نمج بسبب خصوصياتها في الهندسة المعمارية متشابك. ل نمج، الأسلوب الأكثر ملاءمة وناجحة هو تحميل الصبغة من خلال الجذع العصب، وطريقة ملء الأمام 26 ، 27 ، 28 ، 29 . هذه التقنية يمكن استخدامها لتحميل الأصباغ مضان مختلفة في النهايات العصبية الطرفية. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لمحطات العصب ذبابة الفاكهة 28 ، العصب المحرك السحلية28 ، ومحطات العصب المحرك الضفدع 17 ، 26 ، 27 ، 30 . اعتمادا على الكائن قيد الدراسة، يمكن أن تختلف التفاصيل المنهجية. ويمكن استخدام ماصة الزجاج الصغيرة للأعصاب الصغيرة من اليرقات 28 . وقد وصف العديد من الباحثين طريقة 27 ، 28 التي يتم فيها مغمورة نهاية قطع حديثا من العصب تعصب العضلات في بئر مملوءة مسبقا مع صبغ. ثم يترك الإعداد لعدة ساعات لامتصاص الصبغة. يتم غارقة الصبغة حتى من قبل محاور عصبية ونقلها إلى محطات العصب. في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة تحميل مؤشر مضان في محطات العصب المحرك الضفدع من خلال الجذع العصب. يستخدم بروتوكول لدينا طرف ماصة البلاستيك لحضانة الأنسجة مع صبغ. نحن أيضا وصف كيفية الحصول على تحليل كا 2 + مضان تراnsients.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="761">
	<tbody>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:277px;">Ca2+ indicator</td>
			<td style="width:199px;">Molecular Probes, USA</td>
			<td style="width:119px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806</td>
			<td style="width:167px;">500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:277px;">Silicone Elastomer</td>
			<td style="width:199px;">Dow Corning, USA</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184 elastomer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Pipette</td>
			<td style="width:199px;">Biohit, Russia</td>
			<td style="width:119px;">720210</td>
			<td style="width:167px;">0.5-10&#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Pipette tip</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">02-707-175</td>
			<td style="width:167px;">10&#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Pipette tip</td>
			<td style="width:199px;">Biohit, Russia</td>
			<td style="width:119px;">781349</td>
			<td style="width:167px;">10&#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:199px;">Fine scince tools, Canada</td>
			<td style="width:119px;">26002-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Corneal Mini-Scissors</td>
			<td style="width:199px;">MT MEDI CORP, Canada</td>
			<td style="width:119px;">S-1111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Jeweler Forceps</td>
			<td style="width:199px;">MT MEDI CORP, Canada</td>
			<td style="width:119px;">F-9610</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Jeweler Forceps</td>
			<td style="width:199px;">MT MEDI CORP, Canada</td>
			<td style="width:119px;">F-9611</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:277px;">Modelling clay</td>
			<td style="width:199px;">local producer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">can be replaced by any local producer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:277px;">Petroleum jelly</td>
			<td style="width:199px;">local producer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">can be replaced by any local producer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Microspin FV 2400&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Biosan, Latva</td>
			<td style="width:119px;">BS-010201-AAA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Multi-spin MSC 3000</td>
			<td style="width:199px;">Biosan, Latva</td>
			<td style="width:119px;">BS-010205-AAN</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">Single-use hypodermic needles</td>
			<td style="width:199px;">Bbraun</td>
			<td style="width:119px;">100 Sterican</td>
			<td style="width:167px;">0.4&#215;40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Syrynge</td>
			<td style="width:199px;">local producer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">H0887</td>
			<td style="width:167px;">100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Microscope, BX51</td>
			<td style="width:199px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:277px;">Stereomicroscope, Leica &#1052;80</td>
			<td style="width:199px;">Leica Microsystems , Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:277px;">Illumination system Leica CLS 150&#1061;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Leica Microsystems, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Data acquisition system&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:119px;">Digitdata 1550</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="110">
			<td height="110" style="height:110px;width:277px;">software</td>
			<td style="width:199px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:119px;">pClamp software, Version 10</td>
			<td style="width:167px;">protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. 
			RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:277px;">Bath and bath temperature controler</td>
			<td style="width:199px;">Experimental Builder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:277px;">Monochromator</td>
			<td style="width:199px;">Till Photonics, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Polychrome V</td>
			<td style="width:167px;">no longer available, can be replaced by other&#160;&#160; sutable stable light source 488 nm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:277px;">monochromator control software</td>
			<td style="width:199px;">Till Photonics, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Polycon</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:199px;">Redshirt imaging, USA</td>
			<td style="width:119px;">Neuro CCD SMQ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Model 2100 Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:199px;">A-M Systems, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="199">
			<td height="199" style="height:199px;width:277px;">Suction electrode</td>
			<td style="width:199px;">Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob&#8217;ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel&#39;skij zhurnal. -&#160; 2015. &#8211; T. 40. &#8211; &#8470;9. &#8211; S. 13-16.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- 
			biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:277px;">Acquisition software for CCD camera</td>
			<td style="width:199px;">Redshirt imaging, USA</td>
			<td style="width:119px;">Turbo SM software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:277px;">ImageJ</td>
			<td style="width:199px;">National Institutes of Health, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:277px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft, USA</td>
			<td style="width:119px;">Microsoft Office Excel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction

واحدة من الطرق الأكثر جدوى لقياس مستويات الكالسيوم قبل المشبكي في محطات العصب بريسينابتيك هو التسجيل البصري. لأنه يقوم على استخدام الأصباغ الفلورية الحساسة الكالسيوم التي تغير شدة الانبعاثات أو الطول الموجي اعتمادا على تركيز الكالسيوم الحرة في الخلية. هناك العديد من الطرق المستخدمة لصبغ الخلايا مع أصباغ الكالسيوم. الأكثر شيوعا هي عمليات تحميل الأصباغ من خلال ميكروبيبيت أو قبل حضانة مع أشكال استر أسيتوكسيميثيل من الأصباغ. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا تنطبق تماما على التقاطعات العصبية والعضلية (نمجس) بسبب القضايا المنهجية التي تنشأ. في هذه المقالة، نقدم طريقة لتحميل صبغة حساسة للكالسيوم من خلال الجذع العصب الضفدع العصب الضفدع في النهايات العصبية. منذ دخول الكالسيوم الخارجي في محطات العصب واللاحقة ملزمة لصبغة الكالسيوم تحدث داخل ميلي ثانية واحدة على نطاق و، فمن الضروري استخدام نظام التصوير السريع لتسجيل هذه التفاعلينانو ثانية. هنا، نحن تصف بروتوكول لتسجيل الكالسيوم عابرة مع كاميرا كسد سريعة.

بعد تحميل الصبغة وعلى تحفيز العصب الحركي، ويمكن الكشف عن زيادة في السعة من إشارة الفلورسنت (كا 2 + عابرة) في محطات العصب (انظر الشكل 2 ). وترد في الجدول 1 معلمات كا 2+ العابرين. كميا، المعلمات من العابرين كا 2+ تقاس في دراستنا هي قريبة من البيانات التي تم الحصول عليها من قبل علماء آخرين في نقاط الاشتباك العصبي من الحيوانات ذات الدم البارد 15 ، 34 . المعلمات من كا 2+ العابرين تعتمد على معدل ملزمة من كا 2 + مع الصبغة والتفكك اللاحقة. معدل دخول كا 2+ في نهاية العصب، والتفاعل مع الصبغة، ونشرها في السيتوبلازم تؤثر جميعها على ارتفاع وقت الكالسيوم 2+ عابرة. وقت الاضمحلال من إشارة الفلورسنت يعتمد على تقارب الصبغة،وسرعة التفاعل كا 2 + مع المخازن داخل الخلايا، وإزالة بواسطة مضخات أيون 35 . تحليل السعة من كا 2+ العابرين يمكن استخدامها لدراسة تأثير المواد المختلفة على دخول الكالسيوم الذي يشارك في الافراج العصبي 33 . <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" /> الشكل 2 : متوسط ​​كا 2 + عابرة تقاس في الضفدع نمج. تم حساب كا 2 + عابرة على أساس متوسط ​​إشارات من 13 نمجس الضفدع. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> قمةΔF / F (٪) </td><td> ارتفاع الوقت 20٪ -80٪ ​​(مللي ثانية) </td><td> τ (مللي ثانية) </td></tr><tr><td> 12،6 ± 1،1 (ن = 13) </td><td> 4.6 ± 0.5 (ن = 13) </td><td> 115.3 ± 8.3 (ن = 13) </td></tr></tbody></table> الجدول 1: المتوسطات المتوسطة لكا 2+ العابرة. وتعرض البيانات على أنها متوسط ​​± سي؛ n هو عدد القياسات في نمجس متميزة. وتكون الذروة ΔF / F هي متوسط ​​السعة ΔF / F.

Watch this Scientific Journal Video about Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction at JoVE.com

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

هنا، نحن تصف طريقة لتحميل صبغة حساسة للكالسيوم من خلال الجذع العصب الضفدع في النهايات العصبية. كما نقدم بروتوكول لتسجيل وتحليل العابرين الكالسيوم سريع في النهايات العصبية الطرفية.

تحميل صبغ الكالسيوم إلى نهايات العصب الضفدع من خلال الجذع العصبي: تسجيل الكالسيوم العابر في الضفدع العصبي العضلي تقاطع

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

كله من جبل إعداد الكبار ذبابة الفاكهة الحبل الاعصاب الاماميه للحقن صبغ الألياف العملاق

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

تقييم عصبي عضلي وظيفة عن طريق العصب عن طريق الجلد الكهربائية تحفيز

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

المشتركة تسجيل من ميكانيكيا بتنشيط وارد الناتج والأعصاب الطرفية وسمها في ماوس الشعر المسام سناني الشكل النهايات

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

رصد بصري الأعصاب الطرفية المعيشة وصفها في الشعر المسام سناني الشكل النهايات لل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس الأذن الجلد

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em&gt; القيطم المورق</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

العصب الشظية الإصابات الطريقة: مقايسة موثوقة لتحديد واختبار العوامل التي إصلاح العضلية المفارق

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

في فيفو تتبع في محطة Presynaptic الأعصاب الحركية المورفولوجية جزيء واحد

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

ثقافة بيريكيتس الشعيرات الدموية في الدماغ لقياسات الكالسيوم السيتوسوليك ودراسات تصوير الكالسيوم

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...