Name: loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction at JoVE.com

Esta investigación se realizó bajo el programa del Gobierno ruso para el crecimiento competitivo de la Universidad Federal de Kazan y una subvención de la Fundación Rusa para la Investigación Básica (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Damos las gracias a cuatro revisores anónimos por proporcionar comentarios útiles sobre borradores anteriores del manuscrito. Expresamos nuestro agradecimiento a Yuliya Aratskaya por la grabación de voz. Estamos agradecidos al Dr. Victor Ilyin por los muchos comentarios útiles y la ayuda con la edición final del manuscrito.

Se realizaron experimentos en preparaciones aisladas del músculo nervioso del pectoris cutáneo del músculo de la rana Rana ridibunda . El tamaño de los animales de ambos géneros era de unos 5-9 cm. Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices para el uso de animales de laboratorio de la Universidad Federal de Kazan y la Universidad Médica de Kazan, de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El protocolo experimental cumplió los requisitos de la Directiva 86/609 / CEE del Consejo de las Comunidades Europeas y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Kazan. 1. Preparación de las Soluciones <ol><li> Preparación de la solución de Ringer. <ol><li> Preparar la solución de Ringer: NaCl 113,0 mM, KCl 2,5 mM, NaHCO $ ₃ $ 3,0 mM y CaCl $ ₂ $ 1,8 mM. Ajuste el pH a 7.2-7.4. </li><li> Preparar la solución de Ringer con un bajo Ca 2 + </Sup&gt; y alto contenido de Mg ^ { 2+ }: NaCl 113,0 mM, KCl 2,5 mM, NaHCO _ { 3 } 3,0 mM, MgCl _ { 2 } 6,0 mM, CaCl _ { 2 } 0,9 mM. Ajuste el pH a 7.2-7.4. </li></ol></li><li> Preparación de la solución de carga de colorante. <ol><li> Preparar la solución acuosa que contiene HEPES-Na a 10 mM (pH 7,2-7,4). </li><li> Añadir 14 μl de la solución de HEPES a un vial con el colorante 30 . NOTA: el colorante indicador de Ca 2+ viene en un vial de 500 μl con 500 μg de polvo. </li><li> Vórtice y gire hacia abajo para mezclar bien. </li><li> Diluir la solución para llevar la concentración final del indicador Ca2 + a 30 mM. Evite la exposición a la luz y guarde a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Procedimiento de carga de tinte <ol><li> Diseccionar el músculo pectoris cutáneo con una pieza del nervio pectoralis proprius . NOTA: El procedimiento de disección está disponibleEn una descarga gratuita del artículo de Blioch et al. , 1968 31 . <ol><li> Para el procedimiento de disección, use dos fórceps finos y tijeras corneales (vea la Tabla de Materiales ). Transferir el tejido diseccionado en una placa de Petri revestida con elastómero de silicio previamente llena con la solución de Ringer y fijar el tejido con pasadores finos de acero inoxidable de tal manera que se estire ligeramente en el plato. </li><li> Vuelva a llenar la placa de Petri con una alícuota fresca de la solución de Ringer. Quitar los tejidos conectivos. No dañar el nervio. </li></ol></li><li> Prepare la pipeta de llenado: con una cuchilla de afeitar, corte un trozo de ~ 2 mm de longitud de la parte cónica de una punta de pipeta estándar de 10 μl de plástico. </li><li> Prepare una pieza de modelado de arcilla para montar la pipeta de llenado en la placa de Petri. </li><li> Conecte la parte posterior de la pipeta de llenado a una jeringa de plástico a través de tubos de silicona y adaptadores de conexión de plástico hechos de puntas de pipeta. </li><li> Antes de la dProcedimiento de carga, retire la solución de Ringer de la placa de Petri usando una pipeta de plástico. Seque la preparación del músculo-nervio usando una jeringa fina; Esto evitará la dilución del colorante de Ca2 + en la carga subsiguiente de la pipeta de llenado. </li><li> Retire el frasco del indicador Ca 2+ del congelador y deje que se descongela a temperatura ambiente en un lugar oscuro. </li><li> Bajo control de estereomicroscopio con baja ampliación (10 ×), detectar la unión entre el músculo y el nervio. Con pinzas finas y tijeras, corte el nervio peitoral del nervio propio cerca de la superficie del músculo (ver paso 2.1). Deje un muñón nervioso de unos 2 mm de largo. </li><li> Fijar la pipeta de llenado unida a la tubería y la jeringa en la placa de Petri usando arcilla de modelado. </li><li> Mueva la punta de la pipeta cerca del muñón nervioso. </li><li> Sin pellizcarlo, aspirar suavemente el muñón nervioso en la punta de la pipeta de llenado. </li><li> Retire el tubo de succión delT de la pipeta de llenado. </li><li> Retire cuidadosamente el exceso de solución de la pipeta de llenado usando una jeringa con una aguja larga (vea la Tabla de Materiales ). No pellizque el muñón nervioso. </li><li> Levante verticalmente la punta de la pipeta de llenado ligeramente, manteniendo el muñón nervioso aspirado en la punta. </li><li> Aislar la parte aspirada del muñón nervioso desde el exterior de la punta de la pipeta de llenado usando vaselina. </li><li> Secar el muñón nervioso aislado en la pipeta de llenado si es necesario: aspirar suavemente el exceso de solución de la pipeta de llenado usando una jeringa con una aguja larga. </li><li> Dibuje 0,5 μl de la solución de carga de colorante (ver paso 1) usando una pipeta con una punta larga de pipeta. </li><li> Inserte suavemente la punta de la pipeta con la solución de carga en la pipeta de llenado. Expulse la mezcla directamente sobre el muñón nervioso. </li><li> Selle el extremo abierto de la pipeta de llenado con vaselina. </li><li> Añadir una pequeña parte de Ringer sOlución a la placa de Petri para mantener la preparación húmeda. </li><li> Incubar la preparación a temperatura ambiente en condiciones oscuras y húmedas durante 5 h. </li><li> Retirar la pipeta de llenado con solución de carga, enjuagar la preparación con la solución de Ringer y mantenerla durante toda la noche en el frigorífico a 8 ° C. </li></ol> 3. Preparación del tejido para la microscopía <ol><li> Montar la preparación en la cámara recubierta de elastómero de silicio y fijarla con micro agujas de acero de manera que esté ligeramente estirada. </li><li> Enjuague el tejido con una alícuota de solución de Ringer fresca. </li><li> Utilice un electrodo de succión para estimular el nervio; La construcción del electrodo está disponible en la descarga gratuita del documento por Kazakov et al. , 2015 32 . Coloque la punta del electrodo cerca del extremo cortado del nervio y aspire el muñón nervioso en el orificio del electrodo. </li><li> Montar la cámara de preparación en la platina del microscopio. PlacE la sonda de temperatura y las entradas y salidas en la cámara. </li><li> Conecte el cable de alimentación al elemento Peltier. </li><li> Para hacer superfuso la preparación, utilice un sistema de gravedad simple. Para eliminar el exceso de solución, encienda la bomba de succión de perfusión. </li><li> Encienda la termocontroladora. </li><li> Ajuste el control de temperatura a 20 ° C. </li><li> Monte el protector de la protección ultravioleta. </li><li> Conecte el electrodo del electrodo estimulante al estimulador eléctrico y observe las contracciones musculares bajo el microscopio con una lente de objetivo 4x. </li><li> Rellene el sistema de perfusión con la solución de Ringer con bajo contenido de Ca 2+ y alto contenido de Mg 2+ . NOTA: Esta solución se utiliza para prevenir contracciones musculares. Una disminución de la concentración de calcio externo y una elevación del magnesio externo resultan en la reducción de la amplitud de los transitorios de Ca 2+. Sin embargo, en base a la experiencia previa, CaCl 0,9 mM <sub&gt; 2 y 6 mM MgCl2 son todavía suficientes para resolver de forma fiable la amplitud de Ca 2 + transitorios. Cabe mencionar que existen otras formas de disminuir las contracciones musculares sin reducir la concentración de Ca 2+. Por ejemplo, el uso de d-tubocurarina o alfa-bungarotoxina, bloqueadores específicos de los receptores nicotínicos de acetilcolina, bloquearía total o parcialmente las contracciones musculares 17 , 27 , 28 , 30. Sin embargo, la adición de estas toxinas también puede afectar la entrada de calcio presináptica 33 . Para evitar esto, μ-conotoxina GIIIA se puede utilizar [ 27] . </li><li> Encienda la bomba e inicie la superfusión de la preparación con la solución de Ringer con bajo Ca 2+ y alto Mg 2+ . </li><li> Cambie a la lente de objetivo 40 × en el microscopio. </li><li> Encender<html> El monocromador (véase la Tabla de Materiales ). </li><li> Seleccione una longitud de onda de emisión de 488 nm y un modo continuo de iluminación en el software de control de monocromador. </li><li> Bajo alta ampliación en modo de fluorescencia, asegúrese de que las terminales nerviosas se cargan con el tinte. </li></ol><img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig1.jpg" /> Figura 1 : Nervio y terminales con indicador de Ca 2+ cargado. ( A ) Nervio lleno de Ca 2 + indicador después del procedimiento de carga. Barra de escala = 200 μm. ( B ) Terminaciones nerviosas rellenas con el indicador de Ca 2+ . Barra de escala = 20 μm. ( C ) La fluorescencia indicadora de Ca 2+ es claramente visible en la terminación nerviosa. Barra de escala = 20 μm._blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol start="17"><li> Dejar que la preparación se equilibre durante al menos 30 min en la solución baja en Ca2 + y alta en Mg2 + . </li></ol> 4. Captura de video con la cámara digital CCD Nota: Los detalles de captura de las señales de fluorescencia son específicos para cada tipo de microscopio y cámara, pero la consideración clave es la velocidad de captura de la imagen. <ol><li> Utilice 1 kHz como frecuencia de captura mínima para las grabaciones de transitorios individuales de Ca 2+ en el NMJ. NOTA: Las cámaras CCD digitales rápidas son necesarias para la obtención de imágenes de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales ). El sistema de adquisición de datos y el software (véase la Tabla de Materiales ) se utilizaron aquí para la sincronización de la cámara, monocromador y estimulador. En resumen, este protocolo permite la generación de impulsos de sincronización en salidas digitales de los datosAdquisición para abrir el obturador, capturar la señal de video e iniciar la estimulación. Todos los parámetros temporales se pueden ajustar en los protocolos y / o en los aparatos. Un protocolo típico es una serie de 500 tramas adquiridas a 1 kHz (80 x 80 píxeles). La iluminación con luz de excitación puede blanquear el indicador de Ca 2+ y fotodir el tejido celular. Por lo tanto, evitar exposiciones largas a la luz de excitación. En este protocolo, el obturador está abierto sólo por el tiempo necesario para capturar el vídeo. Adquirir veinte series por terminal nervioso específico. El objetivo aquí es monitorear los mismos sitios en el grupo control y después de la administración del fármaco. </li><li> Bajo la lente objetivo 4X de un microscopio, utilice el régimen de campo brillante para visualizar las ramas musculares y nerviosas. </li><li> Cambie a la lente objetivo 40X y, usando el régimen de epifluorescencia y una longitud de onda de excitación de 488 nm, busque las terminaciones nerviosas cargadas de colorante. Identificar una región de interés nervioso que termina. </li><li> En el tubo trinocular oF el microscopio, seleccione los niveles de intercambio de luz: 100% de luz a la cámara. </li><li> Inicie el software de adquisición de la cámara CCD. </li><li> En el modo &quot;Live&quot;, encuentre el ROI y ajuste el enfoque. </li><li> Seleccione el menú &quot;Cambiar&quot;. </li><li> Utilice la &quot;Configuración básica&quot; a 1.000 fotogramas por segundo (fps), con una resolución de 80 x 80. </li><li> Establezca el número de marcos de entrada en 500. </li><li> Introduzca el nombre del experimento. </li><li> Elija &quot;Disparador externo&quot;. </li><li> Ajuste el tiempo de pre-disparo a 10 ms. </li><li> Establezca el número de repeticiones en 20. </li><li> En el software de control monocromador, seleccione una longitud de onda de emisión de 488 nm y el modo &quot;iluminación de disparo externo&quot;. </li><li> Ejecute el software de adquisición de datos. </li><li> Cargue el protocolo de estimulación. </li><li> Antes de grabar el vídeo, capture el marco oscuro utilizando el software de adquisición de vídeo. </li><li> Ejecute el protocolo de estimulación. </li><li> Seleccione ROI y checK la señal grabada. </li></ol> 5. Análisis de datos NoOTE: Para el análisis de datos, utilice el software de cámara CCD y ImageJ; Los datos se representan como una curva en un programa de hoja de cálculo. En el software de cámara CCD, el promedio de 20 se repite y exporta los resultados a un archivo de soporte de ImageJ. En ImageJ, seleccione ROI y fondo. Restar el fondo del ROI. Representar los datos como una relación: (ΔF / F 0 -1) x 100%, donde ΔF es la intensidad de la fluorescencia durante la estimulación y F 0 es la intensidad de la fluorescencia en reposo. <ol><li> En el software de adquisición de la cámara CCD, haga clic en Archivo&gt; Archivos promedio. Selecciona los archivos y media. </li><li> Guarde el archivo promedio como un archivo .fit haciendo clic en &quot;Guardar como archivo de ajuste&quot;. </li><li> Ejecute el software ImageJ. Realice los pasos siguientes: </li><li> Haga clic en Imagen&gt; ajustar&gt; brillo / contraste. </li><li> Haga clic en Imagen&gt; pilas&gt; herramientas&gt;; Clasificador de pilas </li><li> Haga clic en Análisis&gt; herramientas&gt; Administrador de ROI. </li><li> Arrastre y suelte el archivo .fit promedio en la ventana ImageJ. </li><li> Acercar en la ventana para una mejor vista. </li><li> Al mover el cursor, seleccione el último cuadro y elimínelo (este es el marco oscuro) </li><li> Seleccione un ROI rectangular sobre el área que se cree que es el fondo. Añadirlo al gestor de ROI </li><li> Mida el fondo haciendo clic en Más&gt; Multi Medida. Observe el significado. Copie los datos, exportelos a un programa de hoja de cálculo y calcule el valor promedio del umbral para una relación. </li><li> Restar el umbral de las pilas haciendo clic en Proceso&gt; Principal&gt; Restar. Introduzca el valor promedio del umbral. </li><li> Seleccione un ROI rectangular alrededor de una terminal nerviosa. Añadirlo al administrador de ROI. </li><li> Mida haciendo clic en Más&gt; Multi Medida. Observe el significado. Copiar y exportar a un programa de hoja de cálculo. </li><li> Promedio de la compensación de las señales. NOTA: Utilice elPrimero varias docenas de puntos que demuestran la fluorescencia del colorante base sin estimulación; Esta es la fluorescencia en reposo. </li><li> Divida las señales por la fluorescencia en reposo. </li><li> Restar &quot;1&quot; y multiplicar por 100%. </li><li> Trace la señal y calcule la amplitud del transitorio de Ca 2+ . </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction.">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li><li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+activity+but+not+intracellular+calcium+determines+the+time+course+of+endocytosis+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li><li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse.">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li><li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+suction+electrode+for+electrical+stimulation+of+biological+objects.">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), 13-16 (2015).</li><li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction.">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li><li>B&#233;lair, E. L., Vall&#233;e, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs.">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li><li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes.">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li><li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraterminal+Ca2++and+spontaneous+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li><li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++from+one+or+two+channels+controls+fusion+of+a+single+vesicle+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li><li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom.">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li><li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+registration+in+response+to+single+stimulation+and+during+train+of+pulses+in+mouse+neuromuscular+junction.">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo presentamos el método de realizar la carga de colorante sensible al Ca2 + en las terminaciones nerviosas de la rana a través del muñón nervioso. Al final del procedimiento de carga, todos los terminales en la parte proximal del nervio tienen niveles significativos de fluorescencia. Se ha estimado que la concentración intraterminal de la sonda varía entre 40 y 150 μM [ 17] . El procedimiento de incubación se lleva a cabo en dos etapas: a temperatura ambiente y luego a una temperatura más baja en un refrigerador. Es importante controlar el tiempo de incubación del tejido con el colorante a temperatura ambiente. Dependiendo de la longitud real del muñón nervioso, del colorante específico y de la temperatura, el tiempo de incubación puede variar. Si se sobreexpone, las terminales en las partes proximales cercanas al muñón nervioso pueden estar sobrecargadas. Sin embargo, en la parte media del nervio, todavía es posible encontrar terminales que se cargan satisfactoriamente. Durante elDespués de una larga incubación en el refrigerador, el colorante se distribuye uniformemente sobre las terminaciones nerviosas. Nuestras propias observaciones [ 33 , 35] , así como los datos de otros investigadores [ 30] , demuestran la falta de influencia apreciable del procedimiento de carga sobre la amplitud de la respuesta postsináptica o sobre la frecuencia de los potenciales miniatura de la placa terminal. Se documentó una buena longevidad en las preparaciones cargadas. Hay algunos puntos importantes a los que queremos llamar la atención. Es muy esencial colocar el muñón nervioso en la solución de carga de colorante unos minutos después de la excisión para permitir que el colorante entre en los axones del nervio cortado; Los retrasos pueden causar una carga ineficaz, presumiblemente debido al resellado de los axones nerviosos 27 , 36 . Algunos investigadores sumergen el muñón nervioso en 100 mM de EDTA (un Ca 2 + - y Mg 2 + -chelator) Inmediatamente después de la extirpación del nervio para evitar que los axones cortados resellen. El tampón se retira después de 1-2 minutos y se reemplaza con una solución de carga de colorante 37 . El uso de un pozo de gelatina de petróleo en lugar de una tubería de plástico para el procedimiento de carga permite el uso de un muñón nervioso más corto. Mientras se usa este enfoque, el nervio se corta después de sumergido en la solución de HEPES con colorante, y los axones no se vuelven a sellar debido a la falta de iones divalentes en la solución de colorante 27 , 28 . En nuestro estudio, se utilizó la forma de sal soluble en agua del indicador de Ca 2 + en lugar de dextrano. Los conjugados de dextrano difunden en el axón más lentamente que las formas de sal. Sin embargo, el uso del conjugado de dextrano reduce la compartimentación del colorante y la manipulación por el nervio y NMJs. El conjugado de dextrano verde de Calcio Verde de 1-3.000 MW tiene una buena tasa de difusión y demuestra una compartimentación reducida <s<html> Up class = &quot;xref&quot;&gt; 38. Es muy importante evitar un largo período de iluminación fluorescente del tejido, ya que esto afecta su salud y supervivencia. Utilizamos la óptica de Nomarski en el canal de luz visible para buscar terminales nerviosas. Durante la grabación, limitamos el campo iluminado usando un diafragma. Es de destacar que este método de carga es adecuado sólo para preparaciones que pueden soportar incubaciones largas. Para reducir el tiempo de carga de colorante cuando se realizan estudios en tejidos más frágiles ( por ejemplo, sinapsis de animales de sangre caliente), es necesario reducir la longitud del muñón nervioso y utilizar micropipetas para cargar 29 , 39 . Esta técnica de carga es adecuada para los cambios de imagen en el Ca 2+ citosólico, con indicadores fluorescentes tanto en la estimulación de un solo nervio como en la actividad sináptica rítmicaEf &quot;&gt; 17 , 27 , 35. El análisis de la amplitud de transitorios de Ca 2+ puede utilizarse para estudiar la influencia de diferentes sustancias sobre la entrada de calcio que participa en la liberación de neurotransmisores 33 .

Los iones de calcio (Ca 2+ ) participan en muchos procesos de señalización neuronal, incluyendo la iniciación, el mantenimiento y la plasticidad de la liberación del mediador 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Al llegar el potencial de acción, el Ca2 + extracelular entra en el terminal nervioso e inicia la liberación del neurotransmisor. En algunas sinapsis, la corriente de calcio puede medirse directamente por métodos electrofisiológicos 6 , 7 , 8 . En el caso de la unión neuromuscular (NMJ), no se pueden utilizar técnicas de pinza de parche directo y de tensión de dos electrodos debido al tamaño diminuto de las terminaciones nerviosas. Grabaciones de interior Ca 2 + corrientes de las terminaciones nerviosas en el NMJ se puede hacer por electrofys indirectaIológicos 9 , 10 . Sin embargo, estos métodos requieren el pretratamiento de la sinapsis por los bloqueadores de los canales iónicos de sodio y potasio. Los métodos ópticos no requieren la separación farmacológica de las corrientes iónicas en la terminal nerviosa y permiten registros de afluencia de Ca 2+ , desencadenados por los potenciales de acción, y la posterior elevación de iones Ca 2 + en el axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Estos métodos se basan en grabaciones de cambios en la fluorescencia de colorantes específicos sensibles al Ca2 + sobre la unión de iones Ca2 + libres 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Ca 2 + indicadores se pueden cargar en el cElls a través de una variedad de métodos, dependiendo del propósito del experimento. Los investigadores usan la aplicación en el baño de formas de colorante permeables a la membrana 20 , 21 , carga a través de la pipeta de parche 22 , o microinyección 23 , 24 , 25 . Sin embargo, todos estos métodos tienen algunas limitaciones en el caso del NMJ debido a sus peculiaridades en la arquitectura sináptica. Para el NMJ, el método más conveniente y exitoso es cargar el tinte a través del muñón nervioso, un método de llenado hacia delante 26 , 27 , 28 , 29 . Esta técnica puede utilizarse para cargar diversos colorantes fluorescentes en las terminaciones nerviosas periféricas. Este método se utilizó con éxito para las terminales nerviosas Drosophila 28 , el nervio motor lagarto28 , y las terminales nerviosas motoras de la rana 17 , 26 , 27 , 30 . Dependiendo del objeto en estudio, los detalles metódicos pueden variar. Una micro-pipeta de vidrio se puede emplear para los nervios pequeños de las larvas [ 28] . Varios investigadores han descrito un método 27 , 28 en el que un extremo recién cortado del nervio que inerva un músculo se sumerge en un pocillo precargado con un tinte. A continuación, la preparación se deja durante varias horas para sumergir el tinte. El colorante es absorbido por los axones y transportado a las terminales nerviosas. En este artículo, describimos un método de carga de un indicador de fluorescencia en las terminales nerviosas motoras de la rana a través del muñón nervioso. Nuestro protocolo utiliza una punta de pipeta de plástico para la incubación del tejido con un tinte. También se describe cómo adquirir y analizar Ca 2 + fluorescencia traNsients.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="761">
	<tbody>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:277px;">Ca2+ indicator</td>
			<td style="width:199px;">Molecular Probes, USA</td>
			<td style="width:119px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806</td>
			<td style="width:167px;">500 &#956;g</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:277px;">Silicone Elastomer</td>
			<td style="width:199px;">Dow Corning, USA</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184 elastomer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Pipette</td>
			<td style="width:199px;">Biohit, Russia</td>
			<td style="width:119px;">720210</td>
			<td style="width:167px;">0.5-10&#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Pipette tip</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">02-707-175</td>
			<td style="width:167px;">10&#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Pipette tip</td>
			<td style="width:199px;">Biohit, Russia</td>
			<td style="width:119px;">781349</td>
			<td style="width:167px;">10&#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:199px;">Fine scince tools, Canada</td>
			<td style="width:119px;">26002-20</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Corneal Mini-Scissors</td>
			<td style="width:199px;">MT MEDI CORP, Canada</td>
			<td style="width:119px;">S-1111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Jeweler Forceps</td>
			<td style="width:199px;">MT MEDI CORP, Canada</td>
			<td style="width:119px;">F-9610</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Jeweler Forceps</td>
			<td style="width:199px;">MT MEDI CORP, Canada</td>
			<td style="width:119px;">F-9611</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:277px;">Modelling clay</td>
			<td style="width:199px;">local producer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">can be replaced by any local producer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:277px;">Petroleum jelly</td>
			<td style="width:199px;">local producer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">can be replaced by any local producer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Microspin FV 2400&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Biosan, Latva</td>
			<td style="width:119px;">BS-010201-AAA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Multi-spin MSC 3000</td>
			<td style="width:199px;">Biosan, Latva</td>
			<td style="width:119px;">BS-010205-AAN</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">Single-use hypodermic needles</td>
			<td style="width:199px;">Bbraun</td>
			<td style="width:119px;">100 Sterican</td>
			<td style="width:167px;">0.4&#215;40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Syrynge</td>
			<td style="width:199px;">local producer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">H0887</td>
			<td style="width:167px;">100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Microscope, BX51</td>
			<td style="width:199px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:277px;">Stereomicroscope, Leica &#1052;80</td>
			<td style="width:199px;">Leica Microsystems , Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:277px;">Illumination system Leica CLS 150&#1061;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Leica Microsystems, Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Data acquisition system&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:119px;">Digitdata 1550</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="110">
			<td height="110" style="height:110px;width:277px;">software</td>
			<td style="width:199px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:119px;">pClamp software, Version 10</td>
			<td style="width:167px;">protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. 
			RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:277px;">Bath and bath temperature controler</td>
			<td style="width:199px;">Experimental Builder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:277px;">Monochromator</td>
			<td style="width:199px;">Till Photonics, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Polychrome V</td>
			<td style="width:167px;">no longer available, can be replaced by other&#160;&#160; sutable stable light source 488 nm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:277px;">monochromator control software</td>
			<td style="width:199px;">Till Photonics, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Polycon</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:199px;">Redshirt imaging, USA</td>
			<td style="width:119px;">Neuro CCD SMQ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Model 2100 Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:199px;">A-M Systems, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="199">
			<td height="199" style="height:199px;width:277px;">Suction electrode</td>
			<td style="width:199px;">Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob&#8217;ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel&#39;skij zhurnal. -&#160; 2015. &#8211; T. 40. &#8211; &#8470;9. &#8211; S. 13-16.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- 
			biologicheskix-obektov/</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:277px;">Acquisition software for CCD camera</td>
			<td style="width:199px;">Redshirt imaging, USA</td>
			<td style="width:119px;">Turbo SM software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:277px;">ImageJ</td>
			<td style="width:199px;">National Institutes of Health, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:277px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft, USA</td>
			<td style="width:119px;">Microsoft Office Excel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction

Uno de los métodos más factibles de medir los niveles de calcio presináptico en las terminales nerviosas presinápticas es la grabación óptica. Se basa en el uso de colorantes fluorescentes sensibles al calcio que cambian su intensidad de emisión o longitud de onda dependiendo de la concentración de calcio libre en la célula. Hay varios métodos utilizados para teñir las células con tintes de calcio. Los más comunes son los procesos de carga de los colorantes a través de una micropipeta o preincubación con las formas de ésteres acetoximetilo de los colorantes. Sin embargo, estos métodos no son completamente aplicables a las uniones neuromusculares (NMJs) debido a cuestiones metodológicas que surgen. En este artículo presentamos un método para cargar un colorante sensible al calcio a través del tronco del nervio de la rana del nervio de la rana en las terminaciones nerviosas. Dado que la entrada de calcio externo en las terminales nerviosas y la posterior unión al colorante del calcio se producen dentro de la escala de tiempo de milisegundos, es necesario utilizar un sistema de imagen rápida para registrar estas interaccionesNs. Aquí, describimos un protocolo para registrar el transitorio de calcio con una cámara CCD rápida.

Después de la carga del colorante y de la estimulación nerviosa motora, se puede detectar un aumento en la amplitud de la señal fluorescente (transitorio de Ca2 + ) en las terminales nerviosas (ver Figura 2 ). Los parámetros de los transitorios de Ca 2+ se presentan en la Tabla 1 . Cuantitativamente, los parámetros de los transitorios Ca 2 + medidos en nuestro estudio están cerca de los datos obtenidos por otros científicos en las sinapsis de animales de sangre fría 15 , 34 . Los parámetros de los transitorios de Ca2 + dependen de la velocidad de unión de Ca2 + con el colorante y la disociación subsiguiente. La tasa de entrada de Ca 2 + en la terminación nerviosa, la interacción con el colorante y la difusión en el citoplasma afectan el tiempo de subida del transitorio de Ca 2+ . El tiempo de desintegración de la señal fluorescente depende de la afinidad del colorante,La velocidad de la interacción Ca 2 + con los tampones intracelulares, y la eliminación de las bombas iónicas 35 . El análisis de la amplitud de Ca 2 + transitorios se puede utilizar para estudiar la influencia de diversas sustancias en la entrada de calcio que participa en la liberación de neurotransmisores [ 33] . <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" /> Figura 2 : El promedio de Ca 2 + Transitorio medido en la rana NMJ. El Ca 2 + transitoria se calculó sobre la base de la media de las señales de 13 NMJs rana. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Pico Delta F / F (%) </td><td> Tiempo de subida 20% -80% (ms) </td><td> Τ (ms) </td></tr><tr><td> 12,6 pm 1,1 (n = 13) </td><td> 4,6 pm 0,5 (n = 13) </td><td> 115,3 pm 8,3 (n = 13) </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los parámetros promediados del transitorio Ca 2+ . Los datos se presentan como la media ± SE; N es el número de mediciones en NMJs distintos. El pico ΔF / F es la amplitud media de ΔF / F.

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Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Aquí, describimos un método para cargar un colorante sensible al calcio a través del tocón del nervio de la rana en las terminaciones nerviosas. También presentamos un protocolo para el registro y el análisis rápido de los transitorios de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas.

Carga de un tinte de calcio en las terminaciones nerviosas de las ranas a través del tocón nervioso: Registro de transitorios de calcio en la unión neuromuscular de la rana

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