Name: production and administration of therapeutic mesenchymal stem/stromal cell (msc) spheroids primed in 3-d cultures under xeno-free conditions
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions at JoVE.com

This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

1. एमएससी अलगाव और विस्तार <ol><li> तैयारी के लिए केंद्र से जल्दी पारित होने MSCs और वयस्क स्टेम सेल (का वितरण प्राप्त <a href="http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html" target="_blank">http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html</a> ) 15 के रूप में जमे हुए शीशियों। व...

<ol>
	<li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+New+directions.">Mesenchymal stromal cells: New directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li><li>English, K., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation+rejection+and+tolerance.">Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance.</a> Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).</li><li>Le Blanc, K., Mougiakakos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+and+the+innate+immune+system.">Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system.</a> Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).</li><li>Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. 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H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compaction+of+human+mesenchymal+stem/precursor+cells+into+spheres+self-activates+caspase-dependent+il1+signaling+to+enhance+secretion+of+modulators+of+inflammation+and+immunity+(PGE2,+TSG6,+and+STC1).">Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1).</a> Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).</li><li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem/stromal+cells+cultured+as+spheroids+are+self-activated+to+produce+prostaglandin+E2+that+directs+stimulated+macrophages+into+an+anti-inflammatory+phenotype.">Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype.</a> Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).</li><li>Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. 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The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+two+negative+feedback+loops+place+mesenchymal+stem/stromal+cells+at+the+center+of+early+regulators+of+inflammation.">Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation.</a> Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).</li><li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cell+'licensing':+a+multistep+process.">Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process.</a> Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).</li><li>Saleh, F. A., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+round:+multipotent+stromal+cells,+a+three-dimensional+revolution?.">Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?.</a> Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).</li><li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compaction,+fusion,+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate.">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li><li>Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-dependent+regulation+of+spheroid+formation+and+cardiomyogenic+differentiation+for+MSCs+on+chitosan+membranes.">The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes.</a> Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+bullet+formation+via+E-cadherin+promotes+therapeutic+potency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood+for+myocardial+infarction.">Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction.</a> Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).</li></ol>

कुछ अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए इष्टतम एमएससी अत्यधिक उनके लाभ को अधिकतम करने के लिए सक्रिय हो जाना चाहिए, और रियायत के तौर पर रासायनिक परिभाषित एक्सएफ शर्तों के तहत तैयार ऐसे...

Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCs) विभिन्न पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण के लिए महान क्षमता दिखाई है। MSCs शुरू में अस्थि मज्जा का एक stromal घटक के रूप में अलग थे लेकिन जब से वसा ऊतकों 1, 2, 3 सहित कई अन्य वयस्क ऊतकों से प्राप्त किया गया है। दिलचस्प है, मुख्य अलगाव विधि MSCs की उल्लेखनीय संपत्ति भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) की उपस्थिति में टिशू कल्चर प्लास्टिक पर कसकर पालन करने के लिए गले लगाती है। नदीम इस पारंपरिक अलगाव तकनीक दो आयामी (2 डी) संस्कृति में MSCs के आसान और तेजी से विस्तार के परमिट, यह भी बहुत कृत्रिम है और महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताओं 4 के संभावित नुकसान के लिए अग्रणी मूल निवासी तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण के महत्व की उपेक्षा, 5 , 6। इसलिए, 3 डी संस्कृतियों में MSCs का अध्ययन है, जोपारंपरिक 2 डी संस्कृतियों की तुलना में अधिक शारीरिक हैं, &quot;खो / कम&quot; एमएससी विशेषताओं के लिए खोज में उभरा है। इसके अलावा, बहुत रुचि एमएससी संस्कृति और क्रियान्वयन के लिए Xeno मुक्त (XF) रासायनिक परिभाषित की स्थिति की पहचान है, और इस तरह नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं को और अधिक उत्तरदायी बनाने के लिए बढ़ गया है। कई अध्ययनों से दोनों biomaterials में और गोलाकार समुच्चय या spheroids के रूप में MSCS की 3 डी संस्कृति का प्रदर्शन प्रकाशित किया गया है। Biomaterials में MSCs शुरू में, सेल वरीयता प्राप्त scaffolds के साथ क्षतिग्रस्त ऊतकों को बदलने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण के लिए डिजाइन किए गए थे, जबकि MSCS की अंडाकार आकृति संस्कृतियों पूर्व नैदानिक या नैदानिक परीक्षणों में उपचार के लिए कोशिकाओं के प्रशासन के बाद विवो में एमएससी व्यवहार को समझने के लिए एक रास्ता के रूप में देखा गया था 4, 5, 7। दिलचस्प बात यह है MSCs प्रपत्र spheroids अनायास जब टिशू कल्चर प्लास्टिक के पालन की अनुमति नहीं है8, 9, 10। परंपरागत रूप से, सेल एकत्रीकरण स्पिनर कुप्पी तरीकों या तरल ओवरले तकनीक, प्रयासों में कैंसर जीव विज्ञान में शुरू में इस्तेमाल किया ट्यूमर microenvironment की नकल करने की कोशिश करने के तरीकों से मदद की थी। हाल ही में, अतिरिक्त तरीकों सामने आए हैं दिखाना है कि संस्कृति बर्तन में सेल एकत्रीकरण विशिष्ट रसायनों के साथ पूर्व लेपित सेल करने वाली प्लास्टिक आसंजन 4, 5, 6 को रोकने के लिए। सरल और सबसे किफायती तरीकों एमएससी spheroids उत्पन्न करने के लिए एक, एक तकनीक है कि अक्सर भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से embryoid निकायों के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था फांसी बूंदों में उन्हें संस्कृति है। बूंद संस्कृति तकनीक फांसी के साथ, टिशू कल्चर प्लास्टिक के लिए सेल पालन सेल aggreg की सुविधा के लिए एक टिशू कल्चर डिश ढक्कन के नीचे पर मध्यम की एक बूंद में कोशिकाओं को निलंबित और गुरुत्वाकर्षण की इजाजत देने से रोका हैबूंद के शीर्ष में समझना। अंडाकार आकृति आकार में आसानी से, सेल एकाग्रता या ड्रॉप मात्रा बदलते फांसी ड्रॉप संस्कृतियों को नियंत्रित करने के लिए विशेष रूप से आसान बनाने के द्वारा चालाकी से किया जा सकता है। MSCs के 3 डी संस्कृति पर प्रारंभिक अध्ययन के लिए अपने 2 डी समकक्षों 6, 8, 9 की तुलना में 3 डी में कोशिकाओं की विशेषताओं में कट्टरपंथी मतभेद का प्रदर्शन किया। एक ही समय में, रिपोर्ट में प्रदर्शन किया है कि इन विवो में MSCs के लाभदायक प्रभाव उनके जवाब में सूक्ष्म पर्यावरण cues से सक्रिय और बन विरोधी भड़काऊ और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कारकों 11 का उत्पादन करने की क्षमता पर भरोसा किया। दिलचस्प है, इस तरह के प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2), ट्यूमर परिगलन कारक उत्तेजित जीन 6 (TSG6), और hepatocyte वृद्धि कारक (HGF) के रूप में इन कारकों में से कई के लिए रास्ता साफ हो पारंपरिक 2 डी MSCs से एमएससी spheroids से ज्यादा बड़ी मात्रा में उत्पादन किया गया था का विचार3 डी संस्कृतियों का उपयोग कोशिकाओं 8, 12, 13 को सक्रिय करें। इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों में जीन सक्रियण चूहों 12 में इंजेक्शन के बाद तंत्र पुनरावृत्ति करने के लिए, कम से कम हिस्से में, सेल सक्रियण के लिए दिखाई दिया। प्रयोगों में उनके उपयोग के लिए पहले MSCs सक्रिय करके, कोशिकाओं के प्रभाव लंबे समय तक किया जा सकता है और अधिक प्रमुख के रूप में विवो में पारंपरिक एमएससी प्रभाव अक्सर देरी और क्षणिक है, और &#39;के रूप में हिट और रन &quot;में वर्णित किया जा सकता है। पिछले कई वर्षों के दौरान, महत्वपूर्ण कार्यात्मक एमएससी spheroids का उपयोग अध्ययन दिखा दिया है कि वे भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबाने और इस तरह के मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, और टी कोशिकाओं spheroids primed MSCs 2 के एक आकर्षक रूप बनाने के रूप में प्रेरक कोशिकाओं को प्रभावित करने से विवो में प्रतिरोधक क्षमता मिलाना कर सकते हैं 3। इसके अलावा, इस तरह के int के रूप में कैंसर रोधी अणुओं का उत्पादनerleukin -24 (आईएल -24) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर से संबंधित apoptosis उत्प्रेरण ligand (निशान), MSCs monolayer को MSCs रिश्तेदार के 3 डी संस्कृतियों में बढ़ रहे हैं एक घटना है कि लक्षित कैंसर उपचार 8, 10, 14 के लिए शोषण किया जा सकता है। परंपरागत एमएससी संस्कृति की आवश्यकता न केवल टिशू कल्चर प्लास्टिक लेकिन यह भी FBS के उपयोग के रूप में, एक और बाधा एमएससी spheroids अधिक उत्तरदायी बनाने के लिए नैदानिक ​​इस्तेमाल को दूर करने की थी। इस बाधा से निपटने के लिए हमने हाल ही में विशिष्ट रासायनिक परिभाषित एक्सएफ की शर्तों के तहत एमएससी spheroids के गठन से पता चला है और स्थापना की है कि जिसके परिणामस्वरूप एमएससी spheroids FBS के साथ 14 की स्थिति में उत्पन्न spheroids के रूप में ही विरोधी भड़काऊ और विरोधी कैंसर के अणुओं का उत्पादन करने में सक्रिय थे। इधर, इन निष्कर्षों कई विस्तृत प्रोटोकॉल है कि एक्सएफ का उपयोग कर 3 डी संस्कृतियों में पूर्व सक्रिय MSCs की पीढ़ी को प्रदर्शित में प्रस्तुत कर रहेमीडिया। इसके अलावा, प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं कि एक साथ चूहों में बरकरार spheroids वितरित करने के लिए एक व्यावहारिक विधि के साथ, उनके विरोधी भड़काऊ, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी और विरोधी कैंसर प्रभाव के संबंध में MSCs की सक्रियता के स्तर का आकलन करने के लिए प्रभावी तरीके से वर्णन है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEM-&#945; (minimal essential medium alpha)</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>12561049; 12561056; 12561072</td>
			<td>minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (fetal bovine serum), premium select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td>
			<td>component of complete culture media for all types of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>25030081; 25030149; 25030164</td>
			<td>component of complete culture media for all types of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>component of complete culture media for all types of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Filter Units, 0.22 &#181;m PES membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td>
			<td>media sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>D8554&#160;SIGMA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Model 3110</td>
			<td>incubation of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early passage MCSs</td>
			<td>Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&#38;M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott &#38; White</td>
			<td>NA</td>
			<td>preparation of 2D and 3D cultures of MSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-468</td>
			<td>warming media to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>492000904</td>
			<td>manual liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>4-000-300</td>
			<td>handling sereological pipetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487; 4101; 4251; 4490</td>
			<td>liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td>
			<td>cell culture processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin/EDTA solution</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>25200056; 25200072; 25200114</td>
			<td>lifting adherent cells and dispersing cell aggregates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Corning/BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td>Corning/BD Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendor refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf/Fisher Scientific</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26716</td>
			<td>cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154 SIGMA</td>
			<td>dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>A1067501</td>
			<td>Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5420</td>
			<td>Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA (Human serum albumin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Component of xeno-free MSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rHSA (recombinant Human serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9731&#160;SIGMA</td>
			<td>Component of xeno-free MSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel pipette, 10&#8239;&#8211;&#8239;100&#8239;&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022453904</td>
			<td>preparation of hanging drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiashredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Sample homogenization prior to total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free DNase Set&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>On-column DNA elimination during total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250&#160;ALDRICH</td>
			<td>inhibition of RNAses in RLT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td>mixing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>NA</td>
			<td>RNA concentration and quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td>transcription of total RNA into cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Assays</td>
			<td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td>
			<td>varies</td>
			<td>primer/probe combination for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Universal PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td>
			<td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td>
			<td>master mix for real-time PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td>
			<td>ABI Prizm</td>
			<td>NA</td>
			<td>real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>cell centrifugation, sample collection and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-80&#176;C) freezer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Model Thermo Forma 8695</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>KGE004B</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium)</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>10566-016; 10566-024;10566-032</td>
			<td>macrophage culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774 mouse macrophages</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-67</td>
			<td>mouse macrophage cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>in-vitro macrophage stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS (lipopolysaccharide)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4130</td>
			<td>in vitro macrophage stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-a ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>M1000B</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td>splenocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td>in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>In vitro splenocyte stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Splenocyte preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis solution (1x)</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>00-4333</td>
			<td>removal of red blood cells during splenocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MIF 00</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNCaP prostate cancer cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1740</td>
			<td>study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-based cell proliferation assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td>cell number measurement based on DNA content</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>component of lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FERR1021</td>
			<td>calcium chelator, component of lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>RNA degradation for measurement of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-based multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>14175079</td>
			<td>resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthesia for in vivo injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, compressed gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use with isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma BSL-2 cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Model 1385</td>
			<td>Sterile cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR*FNP2025</td>
			<td>Delivery of shperoids into peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile micropipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>varies</td>
			<td>liquid/cells handling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and administration of therapeutic mesenchymal stem/stromal cell (msc) spheroids primed in 3-d cultures under xeno-free conditions

Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (MSCs) जैव प्रौद्योगिकी और पुनर्योजी चिकित्सा में महान वादा पकड़। MSCs टिशू कल्चर प्लास्टिक करने के लिए अपने मजबूत पालन के माध्यम से कई वयस्क ऊतकों से अलग किया जा सकता है और फिर आगे इन विट्रो में विस्तार किया है, सबसे अधिक भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का उपयोग। चूंकि FBS MSCs immunogenic बनने के लिए पैदा कर सकता है, एमएससी संस्कृतियों में अपनी उपस्थिति कोशिकाओं के दोनों नैदानिक ​​और प्रायोगिक अनुप्रयोगों को सीमित करता है। इसलिए, पढ़ाई रोजगार रासायनिक परिभाषित Xeno मुक्त (XF) एमएससी संस्कृतियों के लिए मीडिया अत्यंत मूल्यवान हैं। MSCS की कई लाभकारी प्रभाव इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक उत्तेजित जीन 6 (TSG6) और प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2) के रूप में मुख्य रूप से इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कारकों के स्राव के माध्यम से, सूजन और प्रतिरोधक क्षमता को विनियमित करने के लिए उनकी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। हालांकि, MSCs सक्रियण की आवश्यकता होती है इन कारकों का उत्पादन करने के लिए और बाद MSCs के प्रभाव अक्सर क्षणिक है, बहुत रुचि के पूर्व सक्रिय कोशिकाओं prio के तरीके खोजने के लिए उभरा हैउनके उपयोग के लिए अनुसंधान, इस प्रकार इन विवो में क्रियान्वयन के लिए समय अंतराल को नष्ट करने। यहाँ हम तीन आयामी (3 डी) संस्कृतियों में या प्रोटोकॉल कुशलता से सक्रिय करने के लिए प्रधानमंत्री MSCs पेश रासायनिक परिभाषित एक्सएफ शर्तों के तहत और vivo में इन पूर्व सक्रिय MSCs प्रशासन के लिए। विशेष रूप से, हम पहली बार विधियों का वर्णन गोलाकार एमएससी माइक्रो ऊतकों या फांसी बूंदों में &#39;spheroids&#39; एक्सएफ माध्यम का उपयोग कर पैदा करते हैं और प्रदर्शन कैसे क्षेत्रों और वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री) विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए काटा जा सकता है। दूसरा, हम जीन अभिव्यक्ति स्क्रीन का वर्णन है और इन विट्रो में कार्यात्मक assays तेजी से spheroids में एमएससी सक्रियण के स्तर का आकलन करने के लिए कोशिकाओं के विरोधी भड़काऊ और विरोधी कैंसर संभावित बल। तीसरा, हम इन विवो प्रभावकारिता परीक्षण के लिए माउस पेरिटोनियल गुहा में बरकरार एमएससी spheroids इंजेक्षन करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल के साथ साथ रासायनिक परिभाषित एक्सएफ चुनाव के तहत पूर्व सक्रिय MSCs प्राप्त करने का प्रमुख चुनौतियों पर काबू पानेditions और उपचार के लिए एमएससी spheroids प्रशासन के लिए एक लचीली व्यवस्था प्रदान करते हैं।

वर्तमान काम में, फांसी ड्रॉप संस्कृतियों कॉम्पैक्ट गोलाकार सूक्ष्म ऊतकों या एक्सएफ की शर्तों के तहत सक्रिय MSCS की &#39;spheroids&#39; उत्पन्न करने के लिए कार्यरत थे। चित्रा 1 में अनुसंधानात्मक र...

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Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

उत्पादन और चिकित्सीय mesenchymal स्टेम के प्रशासन / stromal सेल (एमएससी) Spheroids Primed 3-डी संस्कृतियों में अंडर Xeno मुक्त परिस्थितियों

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

निष्प्राण मानव डर्मिस का प्रयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित Organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

अलगाव और mesenchymal स्टेम का विस्तार / stromal कोशिकाओं मानव प्लेसेंटा ऊतकों से निकाली गई

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

फल मक्खी पालन<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; Axenic और Gnotobiotic शर्तों के तहत

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

reprogramming प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली कोशिकाओं एक्सो में Pluripotency करने के लिए-मुक्त शर्तों

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

बँटवारा के दौरान गुणसूत्र अलगाव की लाइव सेल इमेजिंग

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

परिभाषित एक्सो-नि: शुल्क और फीडर-मानव iPSC की पीढ़ी के लिए मुक्त संस्कृति शर्तों-व्युत्पन्न रेटिना सेल मॉडल

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

कम सीरम शर्तों के तहत कार्डियक जनक कोशिकाओं में Endothelial विभेद की प्रेरण

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं के चिकित्सीय प्रत्यारोपण के साथ माउस मस्तिष्क चोट के नियंत्रित Cortical प्रभाव मॉडल

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

एक फीडर में मानव Pluripotent स्टेम सेल से हेमोजेनिक एंडोथेलियम भेदभाव- और Xeno मुक्त परिभाषित हालत

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों के तहत मानव Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करपोस्टाग्लियन सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुशल भेदभाव

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...