Name: large-scale reconstructions and independent, unbiased clustering based on morphological metrics to classify neurons in selective populations
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00
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我々は、博士に感謝したいと思います。エド・キャロウェイとマーティUsrey私たちは神経細胞再構成のヘルプのための先行研究とリビーFairlessとShiyuan劉の一部として調製された組織を使用することを可能にするため。ホワイトホール財団：この作品は、NIH（EY018683 NEI）によって賄われていました。

注：この研究で調べた組織を別の研究5の一部のように調製しました。したがって、動物の使用を含む実験方法の全ては、ブリッグスらの実験方法の節に詳細に記載されています。 （2016年）。前の研究の一環として行われ、動物に関わるすべての手順は、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 2 - dLGNへのウイルスの注入および脳組織の組織学?...

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	<li>Cajal, S. R. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , (1911).</li><li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+functional+connectomics.">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li><li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses.">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li><li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus.">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li><li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey.">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li><li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering.">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li><li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized,+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus.">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rabies+virus+varients+for+monitoring+and+manipulating+activity+and+gene+expression+in+defined+neural+circuits.">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li><li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses.">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li><li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex.">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thalamic+reticular+nucleus:+structure,+function+and+concept.">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+neuroanatomical+methods.">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).</li><li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+belongs+in+the+family?.">Who belongs in the family?.</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li><li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex.">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li><li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina.">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li></ol>

神経解剖学の研究では、神経科学とconnectomicsと構造と機能の関係の最近の関心の柱が選択的ニューロン集団の詳細な形態学的特徴付けのために熱意を更新したままです。伝統的に、神経解剖学の研究では、専門家のneuroanatomistsによって定義されたニューロンの形態学的に異なるクラスにニューロンの定性的な分類に依存してきました。ニューロンを再構築し、形態学的データを抽出するため?...

神経解剖学は、神経科学1の基盤の一つであり、「connectomics」の最近の関心は、ニューロン集団および特定のニューロン2との間の接続の形態的多様性を理解するための熱意をリニューアルしました。標識するための方法および復元ニューロンが大きく、遺伝的およびウイルス媒介回路トレースを含む最近の技術革新と改善しているニューロン集団5のより包括的な形態学的調査を可能にする、3、4に近づきます。個々のニューロンを標識の改善に加えて、定量的なデータ分析技術はまた、それは形態学的データ5、6に基づいて個別の亜集団にニューロンの独立した公正な分類を可能に浮上しています。これらの公平の技術は、よりtraditiona時に改善されています一世紀以上にわたって分野における標準をされているリットル定性的な分類方法。本研究の目的は、アウトラインステップバイステップすることで、選択的な集団内のニューロンのウイルス媒介標識の組み合わせは、これらのニューロンの包括的なサンプル、および定量的なデータ分析の大規模な再構成が持つ独立したクラスタリングに基づきます統計的評価。これらの方法を組み合わせることにより、我々は包括的サンプリングと選択的ニューロン集団内の形態学的にユニークな神経細胞の種類の公平な分類を容易にするために、神経解剖学データの収集と分析に向けた新たなアプローチを概説します。 これらの方法の一例として、我々はマカクザルの視床網様核（TRN）の単一のセクタ内のニューロンの大集団の我々の分析について説明します。これらのデータは、以前の研究7からのものです。選択的背Lateraのに突出したTRNニューロンを標識するための方法EGFP 4、8をコードする改変狂犬病ウイルスの外科的注入を使用して視床（dLGN）のリットルの膝状核が概説されている（ 具体的な材料/設備 、行2 の表を参照してください）。この修正された狂犬病ウイルスは、ウイルスのトランスシナプスの動きを排除する必須のコートタンパク質をコードする遺伝子を欠いています。ウイルスが注射部位での軸索終末に入ると、それは、感染したニューロン5、9、10の完全な樹状樹枝状全体でEGFPの発現を駆動する重要な利点を持つ伝統的な逆行性トレーサーのような役割を果たします。従って、このG欠失狂犬病ウイルスは、選択的に注入し、逆行性輸送、次のいずれかのニューロン集団に感染し、標識するために使用することができます。 特定のニューロン集団の総合的な分析を行うために、それからサンプリングすることが重要です集団内のニューロンの広い分布。ウイルス媒介性標識技術は、完全な細胞内に生成するので、「ゴルジ様」は、ウイルス注射部位における軸索を有する多くのニューロンの充填は、脳構造の完全な範囲内でのニューロンの非常に大きなサンプルを再構成することが可能です。修正された狂犬病ウイルスが感染したニューロンの多数の標識に非常に効果的であるため、また、動物あたりのニューロンの数百を再構成することが可能です。 dLGN投射TRNニューロンの総合的なサンプルを生成するために、TRN 11の視覚的なセクター全体で160ニューロンをサンプリングするための手順が概説されています。顕微鏡、カメラ、および再構成ソフトウェアを含むニューロンの再構成システムを使用して個々のニューロンを再構成する過程を説明します。また（TRN内この場合）脳構造内の個々のニューロンの位置を決定し、ウイルス注入SITを検証する方法が記載さ体積輪郭再構成を使用して（dLGN内でこの場合）構造内の電子の量と場所。形態学的データをエクスポートして、独立したクラスタが各ニューロンのために測定された形態学的評価指標に基づいて分析を実行する手順の概要は次のとおりです。クラスタリング手法には限界がありますし、利用可能な異なるクラスタリングアルゴリズムの様々なもあります。したがって、これらのオプションは、より一般的に使用されるアルゴリズムのいくつかの利点が記載されています。クラスター分析は、クラスタの一意の統計的な検証を提供していません。そのため、追加の手順が最適なクラスタリングだけでなく、クラスタ内および全体の形態学的データ間の関係を確認するために概説されています。そのTRNニューロンを確認するために、TRNデータセットのクラスタを評価するための統計的方法が記載されている10の独立した形態学的指標に基づいて、3つのユニークなクラスタにグループ化されています。 このように、選択的に標識するための手順を概説することにより、、再構築、および特定のニューロン集団から形態学的データを分析し、我々は集団内のニューロン間の形態学的差異を定量化するための方法が記載されています。マカクザルのTRNの視覚的なセクタ内の異なるニューロンタイプの前の調査結果は、別の統計的評価法で確認されています。一緒に、我々は、これらの技術は神経解剖学的データセットに広く適用することと脳を介してニューロン集団の多様性の定量的な分類を確立するのに役立ちます願っています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">SAD&#916;G-EGFP</td>
			<td style="width:171px;">E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Recording electrode: platinum/iridium or tungsten</td>
			<td style="width:171px;">FHC</td>
			<td style="width:133px;">UEPSGGSE1N2M</td>
			<td style="width:281px;">Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:233px;">Nanoject II</td>
			<td style="width:171px;">Drummod Scientific</td>
			<td style="width:133px;">3-000-204, 110V</td>
			<td style="width:281px;">Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:233px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:233px;">DAB</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">D5905-50TAB</td>
			<td style="width:281px;">3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:233px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">C2037-100MG</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:233px;">Catalase</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldich</td>
			<td style="width:133px;">C9322-5G</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies/Thermo Fisher</td>
			<td style="width:133px;">#A-11122&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:233px;">Biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td style="width:171px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:133px;">#BA-1000</td>
			<td style="width:281px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Neurolucida System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">MicroBrightField</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:233px;">Neurolucida Explorer</td>
			<td style="width:171px;">MicroBrightField</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Data export software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Microfire Camera&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Optronics</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Nikon E800 Microscope</td>
			<td style="width:171px;">Nikon Instruments Inc.</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Matlab</td>
			<td style="width:171px;">The MathWorks Inc.&#160;</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Microsoft Office Excel</td>
			<td style="width:171px;">Microsoft</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Spreadsheet program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale reconstructions and independent, unbiased clustering based on morphological metrics to classify neurons in selective populations

このプロトコルは、独立した公正なクラスタリングの使用と組み合わせニューロンの大規模な再構成を概説し、選択的ニューロン集団の間で観察された形態学的特徴の総合的な調査を作成するために分析します。これらの技術の組み合わせは、神経解剖学的データの収集と分析のための新規なアプローチを構成しています。一緒に、これらの技術は、大規模を可能にし、したがって、より包括的、選択的ニューロン集団のサンプリングと集団内の形態学的にユニークなニューロンのクラスを記述するための公平な定量的な方法を確立します。 プロトコルは、選択的ニューロンを標識するための修正された狂犬病ウイルスの使用を概説します。 G-削除された狂犬病ウイルスは、目的の標的脳構造に定位注射後の逆行性トレーサーのように機能し、神経細胞におけるEGFPの送達および発現のための車両として機能します。ニューロンの数が多いと、これを使用して感染しています技術および個々のニューロンの「ゴルジ様」完全な塗りつぶしを生産、彼らの樹状突起全体にGFPを発現します。したがって、ウイルス媒介逆行性トレーシング法は、完全な細胞内の塗りつぶしを生成することによって、従来の染料ベースの逆行トレース技術に改良を加えます。 研究下の脳領域の全領域に及ぶ個々のウェルに単離されたニューロンは、ニューロンの代表的なサンプルを得るために、再構成のために選択されます。プロトコルは、細胞体を再構築し、複数の組織切片にまたがるラベルされたニューロンの樹状突起樹枝状のパターンを完了するための手順の概要を説明します。脳構造内の各ニューロンの位置を含む形態学的データは、さらなる分析のために抽出されます。標準のプログラミング機能は、独立したクラスター分析し、形態学的指標に基づいて、クラスタの評価を行うために利用されました。クラスタ分析perfoのこれらの分析の有用性、統計的評価を確認するにはマカクザルの視床（TRN）の視床網様核に再構成された160のニューロンに行われたrmed。元のクラスター分析とここで行われる統計的評価の両方がTRNニューロンは3亜集団、ユニークな形態学的特性を持つそれぞれに分離されていることを示しています。

我々は、選択的な集団内のニューロンの大規模な再構成がdLGN 5に変更狂犬病ウイルスの注射後可能であることが以前に示されています。最近では、同じ組織はTRNの視覚的なセクターで160ニューロンを再構築するために利用された（ブラッグら 、レビューで; 図2A-B）上記の詳細な方法論的手順以下。 TRNの研究において、TRNニューロン?...

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Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

麻酔ラットのシリコンプローブで大規模なニューロンアンサンブルの録音

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...