Name: large-scale reconstructions and independent, unbiased clustering based on morphological metrics to classify neurons in selective populations
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра. Ed Callaway и Марти Usrey за предоставленную нам возможность использовать ткань, подготовленную в рамках предварительного исследования и Либби Fairless и Шиюань Лю помочь с нейронными реконструкций. Эта работа финансировалась NIH (ЯЭУ: EY018683) и Уайтхолл Фонда.

Примечание: Ткань рассмотрены в данном исследовании , была подготовлена в качестве части отдельного исследования 5. Поэтому все экспериментальные методы , связанных с использованием животных, были подробно описаны в разделе Экспериментальные методы Бриггс и соавт. (20...

<ol>
	<li>Cajal, S. R. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , (1911).</li><li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+functional+connectomics.">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li><li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses.">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li><li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus.">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li><li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey.">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li><li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering.">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li><li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized,+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus.">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li><li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rabies+virus+varients+for+monitoring+and+manipulating+activity+and+gene+expression+in+defined+neural+circuits.">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li><li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses.">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li><li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex.">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thalamic+reticular+nucleus:+structure,+function+and+concept.">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+neuroanatomical+methods.">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).</li><li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Who+belongs+in+the+family?.">Who belongs in the family?.</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li><li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex.">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li><li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina.">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li></ol>

Нейроанатомической исследования оставались опорой нейробиологии и в последнее время интерес к connectomics и структурно-функциональных отношений возобновился энтузиазм по поводу детального морфологического характеристик селективных популяций нейронов. Традиционно нейроанатомические ...

Нейроанатомии является одной из основ нейробиологии 1 и недавний интерес к &quot;connectomics&quot; возобновила энтузиазм для понимания морфологическое разнообразие популяций нейронов и связей между конкретными нейронами 2. Методы маркировки и восстановление нейронов значительно улучшились с последними инновациями, включая трассировку генетического и вируса-опосредованного схемы подходов 3, 4, что позволяет более полные морфологические обследования популяций нейронов 5. В дополнение к улучшению маркировки отдельных нейронов, методы анализа количественных данных также выяснилось , что для проведения независимой и объективной классификации нейронов в различных субпопуляций на основе морфологических данных 5, 6. Эти объективные методы являются усовершенствованием дополнительной traditionaл качественные методы классификации, которые были стандартом в области более ста лет. Цель данного исследования заключается в определении, шаг за шагом, сочетание вирус-опосредованной маркировки нейронов в выборочной совокупности, крупномасштабные реконструкции комплексной выборки этих нейронов и количественного анализа данных на основе независимой кластеризации статистическая оценка. Комбинируя эти методы, мы опишем новый подход к сбору и анализу данных нейроанатомической для облегчения всеобъемлющего отбора проб и объективную классификацию морфологически уникальных типов нейронов в пределах избирательного нейрональной популяции. В качестве примера этих методов, мы опишем наш анализ большого числа нейронов в пределах одного сектора таламуса ретикулярного ядра (TRN) от макаки. Эти данные взяты из предыдущего исследования 7. Методы селективного маркировки TRN нейронов, к спинной Lateraл коленчатое ядро таламуса (dLGN) с помощью хирургического инъекции модифицированного вируса бешенства , кодирующей EGFP 4, 8 (см Таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 2) очерчены. Этот модифицированный вирус бешенства отсутствует ген, кодирующий существенную белковую оболочку, избавляя транс-синаптический движения вируса. После того , как вирус попадает аксонов в месте инъекции, он действует как традиционный ретроградной трассера с важным преимуществом вождения выражение EGFP на протяжении полного ветвления дендритов зараженных нейронов 5, 9, 10. Соответственно, этот G-удален вирус бешенства может быть использован для селективного инфицировать и маркировать любую нейронную популяцию после инъекции и ретроградного транспорта. Для проведения комплексного анализа конкретной нейрональной популяции, важно, чтобы образец изширокое распределение нейронов в популяции. Поскольку вирус-опосредованный метод маркировки производит полный внутриклеточный &quot;Гольджи типа&quot; заполняет многих нейронов с аксонов в месте инъекции вируса, можно реконструировать очень большой выборки нейронов в полном объеме структуры мозга. Кроме того, так как модифицированный вирус бешенства настолько эффективен при заражении и мечения большого количества нейронов, можно реконструировать сотни нейронов на животное. Процедуры отбора проб 160 нейронов по всему визуальному секторе TRN 11 для того , чтобы создать полную выборку dLGN-выступающими нейронов TRN очерчены. Процесс восстановления отдельных нейронов с помощью системы восстановления нейронов, включая микроскоп, камера, и программное обеспечение восстановления описано. Также описаны методы определения позиции отдельных нейронов в пределах структуры мозга (в данном случае в пределах TRN) и для проверки на вирусы инъекции сидячуюОбъем е и местоположение в пределах структуры (в данном случае в пределах dLGN) с использованием объемного контура реконструкций. Шаги для экспорта морфологических данных и выполнить независимую кластерный анализ на основе морфологических показателей, измеренные для каждого нейрона очерчены. Существуют определенные ограничения на методы кластеризации и есть также множество различных алгоритмов кластеризации доступны. Соответственно, эти варианты и преимущества некоторых из наиболее часто используемых алгоритмов описаны. Кластерный анализ не обеспечивает статистическую проверку уникальности кластеров. Таким образом, дополнительные шаги описаны для проверки оптимальной кластеризацию, а также соотношения между морфологическими данными внутри и между кластерами. Статистические методы оценки кластеров для TRN набора данных, чтобы подтвердить, что TRN нейроны сгруппированы в три уникальных кластеров на основе 10 независимых морфологических показателей описаны. Таким образом, рассмотрены основные шаги для селективного маркировки, Реконструкции и анализа морфологических данных от определенного нейронного населения, мы опишем методы количественной оценки морфологических различий между нейронами в пределах популяции. Предварительные выводы различных типов нейронов в пределах визуального сектора макаки TRN подтверждены отдельные методы статистической оценки. Вместе мы надеемся, что эти методы будут широко применяться для нейроанатомической наборов данных и помочь установить количественную классификацию разнообразия популяций нейронов через мозг.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">SAD&#916;G-EGFP</td>
			<td style="width:171px;">E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Recording electrode: platinum/iridium or tungsten</td>
			<td style="width:171px;">FHC</td>
			<td style="width:133px;">UEPSGGSE1N2M</td>
			<td style="width:281px;">Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:233px;">Nanoject II</td>
			<td style="width:171px;">Drummod Scientific</td>
			<td style="width:133px;">3-000-204, 110V</td>
			<td style="width:281px;">Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:233px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:233px;">DAB</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">D5905-50TAB</td>
			<td style="width:281px;">3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:233px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">C2037-100MG</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:233px;">Catalase</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldich</td>
			<td style="width:133px;">C9322-5G</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-GFP</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies/Thermo Fisher</td>
			<td style="width:133px;">#A-11122&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:233px;">Biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td style="width:171px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:133px;">#BA-1000</td>
			<td style="width:281px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Neurolucida System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">MicroBrightField</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:233px;">Neurolucida Explorer</td>
			<td style="width:171px;">MicroBrightField</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Data export software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Microfire Camera&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Optronics</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Nikon E800 Microscope</td>
			<td style="width:171px;">Nikon Instruments Inc.</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Matlab</td>
			<td style="width:171px;">The MathWorks Inc.&#160;</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:281px;">Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Microsoft Office Excel</td>
			<td style="width:171px;">Microsoft</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Spreadsheet program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale reconstructions and independent, unbiased clustering based on morphological metrics to classify neurons in selective populations

Этот протокол описывает крупномасштабные реконструкции нейронов в сочетании с использованием независимого и объективного анализа кластеризации для создания комплексного обследования морфологических характеристик наблюдаемых среди селективного нейронного населения. Сочетание этих методов представляет собой новый подход для сбора и анализа данных нейроанатомической. Вместе эти методы позволяют крупномасштабные, и, следовательно, более всеобъемлющий, отбор проб селективных популяций нейронов и установить объективные количественные методы для описания морфологически уникальных нейронные классов внутри популяции. В протоколе описано использование модифицированного вируса бешенства, чтобы селективно маркировать нейроны. G-удален вирус бешенства действует как ретроградный трассирующими следующие стереотаксической инъекции в целевой структуре мозга интерес и служит в качестве транспортного средства для доставки и экспрессии EGFP в нейронах. Большое количество нейронов заражены с помощью этоготехника и выразить GFP на протяжении всей их дендритов, производя &quot;Гольджи типа&quot; Complete заливку отдельных нейронов. Соответственно, метод ретроградного трассировка вирус-опосредованной улучшает традиционных методов ретроградной трассировки на основе красителя, производя полные внутриклеточные заливок. Отдельные хорошо изолированные нейроны, охватывающие все регионы области мозга при исследовании выбраны для реконструкции для того, чтобы получить репрезентативную выборку нейронов. Протокол изложены процедуры по восстановлению клеток тела и завершить дендритные паттерны разветвление меченых нейронов, разделенного на несколько срезов ткани. Морфологические данные, в том числе позиции каждого нейрона в структуре головного мозга, извлекаются для дальнейшего анализа. Стандартные функции программирования были использованы для выполнения независимого кластерного анализа и оценки кластеров на основе морфологических показателей. Чтобы проверить полезность этих анализов, статистическую оценку кластерного анализа Performed на 160 нейронов реконструированных в таламуса ретикулярного ядра таламуса (TRN) от макаки была сделана. Как оригинальный кластерный анализ и статистические оценки, проведенные здесь, показывают, что нейроны TRN разделены на три субпопуляции, каждая с уникальными морфологическими характеристиками.

Ранее мы показали , что крупномасштабные реконструкции нейронов в пределах выборочной совокупности возможна после инъекции модифицированного вируса бешенства в dLGN 5. В последнее время в той же ткани была использована для восстановления 160 нейронов в зрительной...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations at JoVE.com

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Этот протокол описывает крупномасштабные реконструкций селективных популяций нейронов, меченных следующие ретроградной инфекции с модифицированным вирусом бешенства выражения флуоресцентные маркеры, и независимый, беспристрастный кластерный анализ, которые позволяют всестороннюю характеристику морфологических показателей среди различных нейрональных подклассов.

Масштабные реконструкций и независимой, беспристрастной кластеризация на основе морфологических показателей для Классифицировать Нейроны в селекционных популяциях

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

The goals of this protocol are to describe steps to reconstruct the morphology of virus-labeled neurons and to perform independent, unbiased, cluster analyses on populations of labeled neurons to enable comprehensive characterization of morphological metrics along distinct neuronal subclasses. We outline a novel approach for collecting and analyzing neuroanatomical data to facilitate more comprehensive sampling and unbiased classification of morphologically unique neuronal types within a selective neuronal population. The main advantage of this technique is that it enables large scale analysis of neuronal morphology and utilizes unbiased methods to classify distinct neuronal subclasses.The most challenging aspects of morphological reconstructions are selecting well isolated neurons to reconstruct, assigning the proper z-depth, and aligning arbors to continue reconstructions across adjacent tissue sections. Begin a reconstruction by selecting a slide bearing a stained 50 micron brain tissue section from a primate stereotaxically injected with modified rabies virus expressing EGFP. Place the slide in the microscope slide holder and focus on a single section of interest using a low magnification objective.Make sure the camera image is visible in the live image by properly positioning the camera shutter. Choose a reasonably isolated labeled neuron within the brain structure of interest to enable unambiguous reconstruction of dendritic arborization. Switch to 10x magnification and bring the area into focus.Preferentially choose neurons if the cell body is fully within a single section to accurately estimate its area and roundness. Once a well stained, well isolated neuron is chosen, click the new section button in the software to add the home section containing the cell body to the section manager. Enter the number of sections to include in the reconstruction.Recommend inserting two to three sections to start. Assign a section thickness of 50 microns. Choose the two x objective then click the contour button in the top toolbar and choose the contour type from the dropdown menu.Trace the contour of the target structure by using the mouse to click on points along the contour. When finished tracing the contour, right-click the mouse and select close contour from the menu to close the contour. Next, with the view still at two x, click on the desired marker symbol on the left toolbar.Then click on the center of the target structure to place the marker. Once the contours are complete, select the 40x or 60x objective to trace the outline of the cell body. Then select the neuron tracing button on the top toolbar and select the neuron structure to trace, in this case, cell body, from the dropdown menu.Trace the cell body by clicking on points around the largest extent of the cell body, adjusting the z-depth as needed to bring the cell body in focus. And right-clicking the mouse to finish the cell body contour. Next, place a different style marker at the center of the cell body contour, ensuring that the marker is roughly at the center in z-depth.It's critical to establish the correct z-depth in the home section. as well as in adjacent sections, before beginning each tracing so that z-axis values are accurate. To begin tracing dendritic arbors, select dendrite from the top dropdown menu.Then trace each dendrite starting at the cell body. When a dendrite branches, right-click the mouse and select bifurcating node or trifurcating node to place a node at this branch point. Be sure to adjust the z-depth throughout the tracing to accurately capture the angle and direction of the dendrite.At the end of the dendrite in this section, right-click the mouse and select ending from the dropdown menu. When all dendritic arbors are traced in the home section, identify those dendritic endings that will likely continue into the adjacent section. And bring these into focus at the appropriate z-depth in the microscope image at 20x.Include major landmarks nearby such as blood vessels or easily recognizable dendrite patterns or bundles in the microscope image. Next, take a picture of the live image using a digital camera handheld to the computer screen. Then switch the microscope objective to two x and move to the adjacent section on the slide.Then line up the contours of the previously traced section in the software view with the boundaries of the LGN and TRN in the new section. Return to 20x and align using landmarks. Then, with the aid of the photo of the dendrite endings from the previously traced section, move the tracing to align the dendrites by first using the arrow tool to select the reconstruction.Then right-click and select move from the dropdown menu and move the tracing accordingly. To rotate the tracing, right-click and select rotate from the dropdown menu and rotate the tracing accordingly. Alternatively, select the match tool from the top tools dropdown and select the number of points to match.Then click on the ending in the reconstruction and the corresponding continuation point in the live image to match dendritic endings to beginnings. Once the tracing from the previous section is lined up with the dendrites in the new section, add a new section to the section manager as before. Alternatively, simply select the adjacent section that was created previously and adjust the z-depth in the same manner.Make sure the corresponding new section is selected in the section manager by clicking on the current section. Then, after increasing the magnification to 40x or 60x, select the dendrite using the arrow. Right-click the mouse on the end of the dendrite from the previous section and select add to ending from the dropdown menu.A prompt will ask whether the continuation is in a new section. Click yes. Then trace the continuation of the dendrite using the mouse as a draw tool.Take images of the endings in preparation for aligning to the next section. Then add continuations to dendritic tracings until at least three sections are traced for the neuron or until the dendrites can no longer be followed or found. Using an extraction program associated with the neuron reconstruction system, open a completed reconstruction file.From the edit dropdown menu, select select all objects. Select branch structure analysis from the top analysis toolbar and then click on each tab and select the desired analysis options in each tab. Extract all desired data by clicking the OK button in the analysis window and save in a spreadsheet format by right-clicking on the output windows and selecting export to Excel for further analysis.This photograph shows a single coronal section through the dorsal LGN of one animal. Cytochrome oxidase staining is used to visualize LGN layers. And GFP staining marks the virus injection site.The arrow indicates regions of dense, retrogradely labeled, thalamic reticular nucleus neurons. Section orientation is according to the dorsal ventral medial lateral compass illustrated. The scale bar is illustrated in the bottom left corner.This image shows the contour outlines of the LGN in red and the TRN in maroon for all sections containing virus injection as indicated by the black contours. Yellow stars indicate centers of injection sites. This image shows the 3D rendering of the contours and injection site.This is a map of the locations of reconstructed TRN neurons color-coded according to cluster assignment within a single aggregate TRN contour shown in maroon. The scale bar represent 500 microns. This image shows aggregate contours of TRN in black and the LGN in gray with five reconstructed TRN neurons colored warm to cool according to their medial lateral position within the TRN.The scale bar represents 500 microns. These photographs show the detail of the same five TRN neurons with color matched scale bars representing 100 microns. This hierarchical dendrogram tree illustrates linkage distances between 160 reconstructed TRN neurons based on 10 independent morphological metrics and shows the overall results of the cluster analysis.Three distinct clusters of TRN neurons are illustrated in blue, green, and red. Once these neuronal reconstruction techniques are mastered a single neuron can be completely reconstructed in one to two hours. It is important to constantly monitor and adjust z-depth while reconstructing neurons.The protocol outlined here is an improvement upon traditional, more biased, neuroanatomical analysis methods and enables researchers to explore novel subclasses of neurons based on large-scale morphological data. After watching this video, you should have a good understanding of how to reconstruct neurons through adjacent tissue sections and extract morphological data for further analysis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Физиологические, морфологические и нейрохимические Характеристика нейронов модулируется движением

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation нейронов из кусочков мозга грызунов по изучению синаптической передачи изображения и пресинаптические терминалы

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Запись Крупномасштабные нейронных ансамблей с кремниевых зондов в наркозом крыса

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Селективный Вирусный трансдукция взрослых происхождения обонятельных нейронов при хроническом В естественных условиях Optogenetic Стимуляция

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Крупномасштабные Запись нейронов Зонды Движимое кремния в Поведение грызунов

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Функциональная и морфологическая оценка диафрагмы иннервации диафрагмального по мотонейронов

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...