Name: organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

Nous tenons à remercier les membres du groupe d&#39;oncologie gynécologique pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail est en partie subventionnée par le Conseil australien de la recherche Conseil de recherches médicales de la Santé nationale et, et le cancer Institut NSW (PST). MK est un destinataire de l&#39;Université de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.

Les soins et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives du soin et du Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Université de Newcastle et confirmé à la Loi sur Nouvelle-Galles du Sud animal recherche, Pays de Galles règlement Animal Research New South, et le code australien pour les soins et utiliser des animaux à des fins scientifiques. Toutes les procédures menées sur des souris ont été approuvées par le soin et Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Université de N...

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	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Le système de culture d&#39;organe présente de nombreux avantages par rapport au système de culture cellulaire traditionnel. Ce système conserve les relations structurales originales et des interactions entre les différents types de cellules. Il imite dans des systèmes in vivo et donne des informations plus précises que les études de culture cellulaire , où le facteur de niche est absent. L&#39;utilisation de systèmes de culture d&#39;organes ont même des avantages par rapport à l&#39;aide ...

Le système reproducteur mâle se compose essentiellement de testiculaire, le site pour le développement et la différenciation des cellules germinales et un système ductal complexe qui est nécessaire pour la maturation, le transport et le stockage du sperme. Épididyme est un organe tubulaire qui relie testis avec déférent et principalement impliquée dans le développement post-testiculaire et la maturation des cellules germinales 1. L&#39;épididyme fortement enroulées de souris adulte se développe à partir d&#39; un simple tube et droite précurseur, canal de Wolff (WD) 1. La structure complexe et enroulée du épididyme est essentiel pour les spermatozoïdes d&#39;acquérir la capacité de fertiliser les cellules germinales femelles 2. Comment un tel organe essentiel pour la fertilité masculine se développe et se retrouve dans la forme ne sont pas bien compris. Diverses voies de signalisation ont été révélés être impliqués dans le développement de WD telles que la voie de signalisation Wnt 3,4 et la voie 5 de signalisation des androgènes. Nos travaux récents ont mis en place l&#39;exigence de balbrée signalisation Wnt pour WD lovage au cours du développement prénatal 4. Toutefois, d&#39;autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes impliqués dans postnatale lovage épididymaire, la différenciation cellulaire, et la communication de cellule à cellule dans l&#39;épithélium de l&#39;épididyme et avec des cellules interstitielles. Modèles de souris génétiquement modifiées ont été révélés être un outil puissant pour l&#39; identification / validation des mécanismes moléculaires sous - jacents du développement et de la maladie de divers systèmes d&#39;organes 6. En dépit de son utilisation intensive, il y a des limites importantes de modèles de souris génétiquement modifiés, y compris le phénotype unpredicted de mutants de souris ciblés en ce qui concerne la fonction présumée du gène, et aucun phénotype mutants nuls dans certains modèles, l&#39;influence des facteurs génétiques et environnementaux, de main-d&#39;œuvre et temps processus de développement des modèles de souris. Par conséquent, l&#39;interprétation de la signification des résultats seulement de génétiquement modifiésmodèles de souris fiés est pas toujours simple 6. Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant dans le système de culture d&#39;organe in vitro qui nous donne la souplesse nécessaire pour manipuler les multiples voies de signalisation en temps réel dans des conditions de culture contrôlées. Système de culture d&#39;organes joue un rôle dans la compréhension de la physiologie et de la pathologie des organes entiers 7. En outre, l&#39; imagerie d&#39;organes entiers colorés avec des anticorps fluorophores marqués nous permet de visualiser les marqueurs d&#39;intérêt dans un contexte tridimensionnel, tel qu&#39;il existe in vivo, fournissant ainsi une meilleure compréhension de la forme de l&#39;organe, la structure et la fonction 8. Ici, nous avons décrit les méthodes d&#39;isolement des souris crêtes gonadiques embryonnaires, la culture in vitro et toute la montagne immunofluorescence imagerie de WDs, qui peuvent être appliquées pour répondre à une variété de questions relatives à la morphogenèse des organes tubulaires tels que WDS. Dans ce protocole, nousisolées souris embryonnaires crêtes urogénitales de 15,5 jours après le coït (dpc) barrages enceintes et les cultivées pendant 3 jours, suivi par immunocoloration pour un marqueur des cellules épithéliales (cytokératine 8, CK8), un marqueur de prolifération cellulaire (phospho-histone 3, PH3) et active βcatenin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">24 well plates</td>
			<td style="width:195px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:136px;">3524</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30031.02</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D8437</td>
			<td style="width:191px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Interpath,&#160; Australia</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:191px;">10% FBS used in culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:136px;">15070-063</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Whatman, USA</td>
			<td style="width:136px;">110409</td>
			<td style="width:191px;">Membrane (0.8 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">IWR1</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">10161-5mg</td>
			<td style="width:191px;">100 &#181;M concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">15710</td>
			<td style="width:191px;">16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot 
			be disposed of in the sink</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">214-20L PL</td>
			<td style="width:191px;">Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">2509-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">T8787-50ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">621-500mg</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Di-hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Ajax Finechem, USA</td>
			<td style="width:136px;">4745-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">465-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:247px;">Cytokeratin8/Troma I</td>
			<td style="width:195px;">Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td>
			<td style="width:136px;">TROMA-I</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">active &#946;catenin&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Cell Signalling Technology,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">D13A1</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">Phospho-Histone3</td>
			<td style="width:195px;">Millipore, MA, USA</td>
			<td style="width:136px;">06-570</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">111-545-047</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:247px;">Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">112-585-072</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">242-500ml</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">n-Propyl galate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">2370</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D9564-10mg</td>
			<td style="width:191px;">Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">2225-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cover Slips (24x50 mm)</td>
			<td style="width:195px;">Lomb Scientific</td>
			<td style="width:136px;">CS24501GP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

morphogenèse Tubal est une exigence fondamentale pour le développement de la plupart des organes de mammifères, y compris le système reproducteur masculin. L&#39;épididyme, une partie intégrante de l&#39;appareil reproducteur masculin, est responsable de la conservation de sperme, la maturation et le transport. L&#39;épididyme adulte est un tube très enroulé qui se développe à partir d&#39;un précurseur embryonnaire simple et droite connu comme canal de Wolff (WD). lovage correcte de l&#39;épididyme est essentiel pour la fertilité masculine, comme le sperme dans les testicules sont incapables de féconder un ovocyte. Cependant, le mécanisme responsable du développement de l&#39;épididyme et lovage reste incertaine, en partie à cause du manque de culture d&#39;organes et d&#39;imagerie méthodes entières. Dans cette étude, nous décrivons un système de culture in vitro et le protocole entier immunofluorescence mount pour mieux visualiser le processus de WD lovage et le développement, qui peut également être appliquée à l&#39; étude d&#39; autres organes tubulaires.

Au cours du développement, le WD subit des changements significatifs dans lequel un tube simple et droite se transforme en un conduit très complexe et enroulé. En utilisant des procédés décrits ci-dessus, WDs subissent une transformation similaire dans des conditions de culture. Ici , nous avons montré les résultats de WDs cultivés pendant 3 d (figure 3). Pour disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse WD, le milieu de culture peut être complétée avec des inhib...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Nous présentons une méthode pour l&#39;isolement et la culture du canal de Wolff de la souris (WD). Nous démontrons également une procédure détaillée pour l&#39;ensemble de l&#39;immunocoloration mont de culture / WDs fraîchement isolés avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l&#39;étude du développement WD, enroulement, et la différenciation.

Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

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