Name: organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00
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우리는이 원고의 중요한 읽기 위해 부인과 종양학 그룹의 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 부분적으로 국립 보건 의료 연구위원회, 호주 연구위원회, 그리고 암 연구소 NSW (PST)에서 자금을 지원합니다. MK 뉴캐슬 대학원 연구 활동의 대학을받는 사람입니다.

동물 관리 및 실험 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 법, 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 규제 및 관리를위한 호주 코드와 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행하고 확인 하였다 과학적 목적을 위해 동물의 사용합니다. 마우스에 착수 모든 절차는 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1 시간 짝짓기 <ol><li> 쌍 6~8주 세 남성 및 일?...

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

장기 배양 시스템은 기존의 세포 배양 시스템에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 시스템은 서로 다른 세포 유형 사이의 원래 구조 관계와 상호 작용을 유지합니다. 이는 생체 내 시스템에서 모방하고 틈새 계수가없는 세포 배양 과정보다 더 정확한 정보를 제공한다. 기관 배양 물 시스템의 사용은 심지어 전체 동물을 사용하여보다 이점이있다. 이 전체 동물, 쉽게 관리 및 기관 배양 물 시스템?...

남성 생식은 주로 고환 이루어져 생식 세포의 발생과 분화 및 정자의 성숙, 전송 및 저장을 위해 요구되는 복잡한 도관 시스템 사이트. 부고환은 정관과 고환 및 생식 세포 (1)의 후 고환 발달과 성숙에 주로 관여를 연결하는 관 모양의 기관이다. 고도로 꼬인 성인 마우스 부고환 간단한 직선 전구체 튜브 Wolffian 덕트 (WD) (1)로부터 발생한다. 정자 여성 생식 세포이 기름지게하는 능력을 획득하는 부고환 복잡하고 코일 구조가 필수적이다. 남성 불임에 대한 이러한 중요한 장기가 형태로 개발하고 얻는 방법을 잘 이해되지 않는다. 다양한 신호 경로는 예 Wnt 신호 전달 경로 및 경로 3,4- 5 시그널링 안드로겐으로 WD의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 최근 작품은 벨의 요구를 설립했다고급의 Wnt는 태아 개발 4시 WD의 코일 링에 대한 시그널링. 그러나, 상기 연구는 부고환 내 상피 및 간질 세포 생후 부고환 권취, 세포 분화 및 세포 간 통신에 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다. 유전자 변형 마우스 모델은 다양한 기관 시스템 (6)의 개발 및 질병을 기본 분자 메커니즘의 식별 / 검증을위한 강력한 도구로 입증되었습니다. 광범위한 사용에도 불구하고, 추정 유전자 기능에 관해서 타겟 마우스 돌연변이의 예상치 못한 표현형, 일부 모델에서 널 (null) 돌연변이에 더 표현형, 유전 적, 환경 적 요인의 영향, 노동 집약적 등 유전자 변형 마우스 모델의 중요한 제한이있다 시간 소모적 마우스 모델을 개발하는 과정. 따라서, 단지 MODI 유전자에서 발견의 중요성 해석들이었다 마우스 모델은 항상 6 간단하지 않다. 이러한 제한은 우리 제어 배양 조건에서 실시간으로 다수의 신호 경로를 조작 할 수있는 유연성을 제공 관내 기관 배양 물 시스템의 사용에 의해 극복 될 수있다. 기관 배양 물 시스템은 전체 기관 (7)의 생리 병리학을 이해하는 수단이있다. 이되어 장기의 형태, 구조 및 기능 (8)의 더 나은 이해를 제공하고, 생체 내에서 존재하는 또, 형광 표지 된 항체로 염색하여 전체 장기의 화상은, 입체적 환경에서 관심있는 마커를 시각화 우릴 수있다. 여기, 우리는 WDS와 같은 관상 기관의 형태 형성에 대한 질문의 다양한 대답을 적용 할 수 있습니다 마우스 배아 생식 능선의 분리, 체외 문화와 WDS의 전체 마운트 면역 형광 이미징을위한 방법을 설명했다. 이 프로토콜에서, 우리15.5 일에서 격리 된 마우스 배아 비뇨 생식기 능선은 교미 (DPC) 임신 댐을 게시하고 상피 세포 마커 (사이토 케라틴 8, CK8), 세포 증식 마커 (포스 포 히스톤 3, PH3) 및 활성에 대한 면역 염색 한 다음 3 일 동안을 배양 βcatenin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">24 well plates</td>
			<td style="width:195px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:136px;">3524</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30031.02</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D8437</td>
			<td style="width:191px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Interpath,&#160; Australia</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:191px;">10% FBS used in culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:136px;">15070-063</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Whatman, USA</td>
			<td style="width:136px;">110409</td>
			<td style="width:191px;">Membrane (0.8 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">IWR1</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">10161-5mg</td>
			<td style="width:191px;">100 &#181;M concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">15710</td>
			<td style="width:191px;">16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot 
			be disposed of in the sink</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">214-20L PL</td>
			<td style="width:191px;">Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">2509-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">T8787-50ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">621-500mg</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Di-hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Ajax Finechem, USA</td>
			<td style="width:136px;">4745-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">465-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:247px;">Cytokeratin8/Troma I</td>
			<td style="width:195px;">Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td>
			<td style="width:136px;">TROMA-I</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">active &#946;catenin&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Cell Signalling Technology,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">D13A1</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">Phospho-Histone3</td>
			<td style="width:195px;">Millipore, MA, USA</td>
			<td style="width:136px;">06-570</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">111-545-047</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:247px;">Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">112-585-072</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">242-500ml</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">n-Propyl galate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">2370</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D9564-10mg</td>
			<td style="width:191px;">Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">2225-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cover Slips (24x50 mm)</td>
			<td style="width:195px;">Lomb Scientific</td>
			<td style="width:136px;">CS24501GP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

두발 형태 형성은 남성 생식 기관을 포함한 대부분의 포유 동물의 개발을위한 기본 요건이다. 부고환, 남성 생식 기관의 중요한 부분은 기억 정자 성숙 및 전송에 대한 책임이있다. 성인 부고환은 Wolffian 덕트 (WD)로 알려진 단순하고 직선 배아 전구체로부터 개발하는 높은 코일 튜브입니다. 고환에서 정자가 난자와 수정 할 수 없습니다로 부고환의 적절한 코일 링은 남성 불임 필수적이다. 그러나, 부고환 개발 및 권취를 담당하는 메카니즘은 부분적으로 전체 기관 배양 및 촬상 방법의 부족으로 불분명. 본 연구에서, 우리는 더 나은 다른 관형 기관을 연구하기 위해 적용될 수있다 WD의 권취 및 발전 과정을 시각화 관내 배양 시스템 및 전체 마운트 면역 형광 프로토콜을 설명한다.

개발하는 동안, WD는 단순한 직선 튜브는 매우 복잡하고 코일 덕트로 변환되는 것을 특징으로 상당한 변화를 겪는다. 전술 한 방법을 사용하여, WDS는 배양 조건에서 유사한 변화를 겪는다. 여기에서 우리는 3 일 (그림 3) 배양 WDS의 결과를 보여 주었다. WD의 형태 형성에 관여하는 분자 메커니즘을 해부 배양액 다른 신호 경로를 표적 억제제 및 활성제로 보충 될 수있다. 그림 3C 특?...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Research

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Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

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발생학

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전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

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Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

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Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

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Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

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Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

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전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

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Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...