Name: organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmarna i gynekologi Oncology Group för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete är delvis stöds av finansiering från National Health och Medical Research Council, Australian Research Council, och Cancer Institute NSW (PST). MK är en mottagare av University of Newcastle forskarutbildning Fellowship.

Djuromsorg och experimentella procedurer genomfördes i enlighet med riktlinjerna för Animal Care och etikkommittén vid University of Newcastle och bekräftat för New South Wales Animal Research lagen, New South Wales Animal Research förordningen, och den australiensiska koden för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål. Alla förfaranden genomförs på möss har godkänts av Animal Care och etikkommittén vid University of Newcastle. 1. Tids Parning <ol><li> Paret ...

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Organkultursystem har många fördelar jämfört med traditionella cellodlingssystem. Systemet behåller de ursprungliga strukturella relationer och interaktioner mellan olika celltyper. Det härmar in vivo-system och ger mer exakt information än cellkulturstudier där nisch faktorn är frånvarande. Användningen av organkultursystem har även fördelar jämfört med användning av hela djuret. Dessa inkluderar den högre kostnaden för att använda hela djuret, enkel skötsel och underhåll av organkultursys...

Det manliga reproduktiva systemet består huvudsakligen av testikel, platsen för bakterieceller utveckling och differentiering, och ett komplex gångsystemet som krävs för mognaden, transport, och lagring av sperma. Bitestikeln är ett rörformat organ som förbinder testikeln med sädesledaren och huvudsakligen är verksamma inom posttestikel utveckling och mognad av könsceller 1. De mycket lindade vuxen mus epididymis utvecklas från en enkel och rak föregångare rör Wolffian kanal (WD) 1. Komplexet och lindade struktur bitestiklarna är viktigt för spermier att förvärva förmågan att befrukta kvinnliga könsceller 2. Hur en sådan viktig organ för manlig fertilitet utvecklar och får i form är inte väl förstådd. Olika signalvägar har visat sig vara involverad i utvecklingen av WD såsom Wnt-signalväg 3,4 och androgen signalväg 5. Vårt senaste arbete har etablerat kravet på balserad Wnt signalering för WD lindning under fosterutvecklingen 4. Dock ytterligare studier krävs för att förstå de mekanismer som är involverade i postnatal epididymalt ringlande, celldifferentiering, och cell-till-cellkommunikation i epididymal epitel och interstitiella celler. Genetiskt modifierade musmodeller har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att identifiera / validering av molekylära mekanismer som ligger bakom utveckling och sjukdom i olika organsystem 6. Trots sin omfattande användning, finns det betydande begränsningar av genetiskt modifierade musmodeller, inklusive oförutsedda fenotypen riktade mutanter mus med avseende på förmodad genfunktion, och ingen fenotyp i null mutanter i vissa modeller, påverkan av genetiska faktorer och miljöfaktorer, arbetsintensiv och tidskrävande process att utveckla musmodeller. Därför tolkningen av betydelsen av resultaten endast från genetiskt modifieraderade musmodeller är inte alltid okomplicerat 6. Dessa begränsningar kan övervinnas genom användning av in vitro organkultursystem som ger oss flexibilitet att manipulera flera signalvägar i realtid i kontrollerade odlingsbetingelser. Organkultursystem är avgörande för att förstå fysiologi och patologi hela organ 7. Dessutom avbildning av hela organ färgade med fluoroformärkt antikroppar ger oss möjlighet att visualisera de markörer av intresse i en tredimensionell sammanhang som den existerar in vivo, varigenom en bättre förståelse av organet form, struktur och funktion 8. Här har vi beskrivit metoder för isolering av mus embryonala gonadala åsar, in vitro-kultur och hela montera immunofluorescens avbildning av WDS, som kan användas för att besvara en mängd frågor som rör morfogenes av rörformiga organ såsom WDS. I detta protokoll, viisolerade mus embryonala urogenitala åsar från 15,5 dagar efter coitum (DPC) gravida dammar och odlade dem för 3 d följt av immunfärgning för en epitelcell markör (cytokeratin 8, CK8), en cell proliferation markör (fosfo-Histon 3, PH3) och aktiv βcatenin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">24 well plates</td>
			<td style="width:195px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:136px;">3524</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30031.02</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D8437</td>
			<td style="width:191px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Interpath,&#160; Australia</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:191px;">10% FBS used in culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:136px;">15070-063</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Whatman, USA</td>
			<td style="width:136px;">110409</td>
			<td style="width:191px;">Membrane (0.8 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">IWR1</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">10161-5mg</td>
			<td style="width:191px;">100 &#181;M concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">15710</td>
			<td style="width:191px;">16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot 
			be disposed of in the sink</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">214-20L PL</td>
			<td style="width:191px;">Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">2509-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">T8787-50ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">621-500mg</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Di-hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Ajax Finechem, USA</td>
			<td style="width:136px;">4745-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">465-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:247px;">Cytokeratin8/Troma I</td>
			<td style="width:195px;">Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td>
			<td style="width:136px;">TROMA-I</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">active &#946;catenin&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Cell Signalling Technology,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">D13A1</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">Phospho-Histone3</td>
			<td style="width:195px;">Millipore, MA, USA</td>
			<td style="width:136px;">06-570</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">111-545-047</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:247px;">Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">112-585-072</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">242-500ml</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">n-Propyl galate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">2370</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D9564-10mg</td>
			<td style="width:191px;">Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">2225-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cover Slips (24x50 mm)</td>
			<td style="width:195px;">Lomb Scientific</td>
			<td style="width:136px;">CS24501GP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

Äggledarna morfogenes är en grundläggande förutsättning för utvecklingen av de flesta däggdjurs organ, inklusive det manliga reproduktiva systemet. Bitestiklarna, en integrerad del av den manliga genitalia, är ansvarig för spermie lagring, mognad och transport. Den vuxna bitestikeln är en mycket spiralformat rör som utvecklas från en enkel och rak embryonala prekursor kallas Wolffian kanal (WD). Rätt ringlande i bitestiklarna är viktigt för manlig fertilitet, som spermier i testiklarna inte kan befrukta en äggcell. Dock kvarstår den mekanism som ansvarar för epididymal utveckling och lindning oklart, delvis på grund av bristen av hela organkultur och avbildningsmetoder. I denna studie beskriver vi en in vitro-odlingssystemet och hela montera immunofluorescens-protokoll för att bättre visualisera processen för WD lindning och utveckling, vilket också kan tillämpas för att studera andra rörformiga organ.

Under utveckling, WD genomgår stora förändringar där en enkel och rakt rör förvandlas till en mycket komplex och lindade kanal. Med användning av metoder som beskrivits ovan, WDS undergår en liknande omvandling i odlingsbetingelser. Här har vi visat de resultat från WDS odlade under 3 d (Figur 3). Att dissekera molekylära mekanismer som är involverade i WD morfogenes kan odlingsmediet kompletteras med hämmare och aktivatorer inriktade på olika signalvägar. Figur 3C visar ...

Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Vi presenterar en metod för isolering och odling av mus Wolffian kanalen (WD). Vi visar också en detaljerad beskrivning av hela berget immunfärgning av odlade / nyligen isolerade WDS med fluorescerande taggade antikroppar. Tillsammans utgör dessa tekniker möjliggör studier av WD utveckling, ringlande och differentiering.

Organ kultur och Hela Mount immunofluorescensfärgning av Mus Wolffian kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Metod för att studera Palatal Fusion använder statiska orgel kultur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisera Multiciliated celler i zebrafisk genom en kombinerad protokoll av hela Mount fluorescerande In Situ hybridisering och immunofluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hela-mount Clearing och färgning av Arabidopsis blomma organ och Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hela berget immunofluorescens och follikeln kvantifiering av odlade mus äggstockarna

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analys av hjärtats kammare utveckling under musen embryogenes använder hela Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation av Organoids från mus extrahepatiska gallgångarna

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...