Name: genome-wide analysis of hdac inhibitor-mediated modulation of micrornas and mrnas in b cells induced to undergo class-switch dna recombination and plasma cell differentiation
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH AI 105813 ו- AI 079705 (למחשב), הברית לזיהוי לופוס מחקר היעד בלופוס גרנט ALR 295955 (למחשב), המחקר דלקת מפרקים קרן מחקר לאומי להעניק (HZ). TS נתמכה על ידי ברפואת ילדים במרכז הרפואי, החולים Xiangya השנייה, אוניברסיטת דרום סנטרל, צ'אנגשה, סין, בהקשר של התוכנית הביקור של סטודנט לרפואה Xiangya-UT הספר של רפואה סן אנטוניו.

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים והטיפול שימוש ועדות של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז סן אנטוניו.
 1. גירוי של העכבר בתאי B CSR, פלזמה תאית התמיינות של טיפול HDI <ol><li>הכנה של הטחול תא המתלים הערה: לבצע את כל השלבים ב תא למינארי מלבד העכ?...

<ol>
	<li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control.">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li><li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+of+the+antibody+response.">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).</li><li>Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+of+Peripheral+B-Cell+Differentiation+and+the+Antibody+Response.">Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response.</a> Front Immunol. 6, 631 (2015).</li><li>Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+class-switch+DNA+recombination:+induction,+targeting+and+beyond.">Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+upregulate+B+cell+microRNAs+that+silence+AID+and+Blimp-1+expression+for+epigenetic+modulation+of+antibody+and+autoantibody+responses.">Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses.</a> J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).</li><li>Farh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+fine+mapping+of+causal+autoimmune+disease+variants.">Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants.</a> Nature. 518, 337-343 (2015).</li><li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis.">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).</li><li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform.">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).</li><li>Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+selective+modulation+of+microRNAs+and+mRNAs+by+histone+deacetylase+inhibitor+in+B+cells+induced+to+uUndergo+class-switch+DNA+recombination+and+plasma+cell+differentiation.">Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation.</a> Front. Immunol. 6, 627 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Kin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fRNAdb:+a+platform+for+mining/annotating+functional+RNA+candidates+from+non-coding+RNA+sequences.">fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=doRiNA:+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation.">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק גישות מקיף לזירוז תא B class מיתוג ובידול תאים פלזמה; כדי לנתח את השפעתם על ידי epigenetic מאפננים, כלומר HDI; כדי לזהות את ההשפעה של HDI על mRNA והביטוי miRNA בתאים אלה. רוב הגישות הללו יכולים לשמש גם כדי לנתח את השפעת גורם epigenetic על הביטוי mRNA/miRNA והפונקציה B-cell האנושי. לרביעיית-PCR וגישות mRNA-seq/...

סימני epigenetic או גורמים, כגון מתילציה DNA, שינויים posttranslational היסטון אי קידוד RNAs (כולל מיקרו Rna), לווסת את תפקוד התא על ידי שינוי בביטוי גנים1. שינויים epigenetic לווסת את פונקציית B לימפוציטים, כגון אימונוגלובולינים מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) היפרמוטציה (SHM), התמיינות תאי זיכרון B או תאים פלזמה, ובכך להתכוונן נוגדן של נוגדן עצמי תגובות2,3. CSR SHM אנושות דורשים הפעלה-induced cytidine deaminase (סיוע, המקודדים כ- Aicda), אשר הוא מאוד המושרה בתאי B בתגובה תלויי-T ו- T-עצמאית אנטיגנים4. בתאי B class-החלפת/hypermutated נוספות להבדיל לתאי פלזמה, אשר מפרישים כמויות גדולות של נוגדנים אופנה אנושות תלויה ההבשלה לימפוציטים B-induced חלבון (Blimp1, בקידוד Prdm1) 15. שינויים epigenetic נורמלי בתאי B עלול לגרום תגובות נוגדנים סוטה/נוגדן עצמי, אשר יכול להוביל תגובה אלרגית או מחלת חיסון עצמי1,4. הבנת epigenetic כמה גורמים, כגון miRNAs, לווסת תא B-מהותי ביטוי גנים הוא לא רק חשוב להתפתחות חיסון, אך היא חיונית כדי לחשוף את המנגנון של תגובות נוגדנים חריג/נוגדן עצמי פוטנציאליים.
היסטון acetylation deacetylation שינויים של משקעי ליזין על חלבוני היסטון מזורז בדרך כלל על ידי היסטון acetyltransferase (כובע) היסטון deacetylase (HDAC) בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. לבצע שינויים אלה להוביל הנגישות עולה או יורדת של כרומטין, עוד יותר לאפשר או למנוע את הכריכה של גורמי שעתוק או חלבונים ל- DNA ואת משינוי של ג'ין ביטוי5,6, 7 , 8. מעכבי HDAC (HDI) הם קבוצה של תרכובות להפריע הפונקציה של HDACs. כאן השתמשנו HDI (VPA) לכתובת ברגולציה של HDAC על הפרופיל ביטוי גנים פנימיים של תאים B ועל מנגנון שלה.
miRNAs הם קטנים, ללא קידוד RNAs כ 18 עד 22 נוקלאוטידים אורך הנוצרות דרך מספר שלבים. miRNA מארח את הגנים הם עיבד ויוצרים מיקרו Rna ראשוני סיכת ראש (pri-miRNAs). והם מיוצאים אל הציטופלסמה, איפה pri-miRNAs הם עיבוד נוסף לתוך קודמן miRNAs (pre-miRNAs). לבסוף, בוגרת miRNAs נוצרות דרך החריץ של טרום-miRNAs. miRNAs לזהות את רצפי משלימה באזור 3' לא מתורגם של6,mRNAs7שלהם היעד. דרך להשתיק post-transcriptional, miRNAs לווסת את פעילות הסלולר, כגון התפשטות, התמיינות אפופטוזיס10,11. כיוון miRNAs מרובים ניתן לייעד את ה-mRNA זהה, miRNA יחיד אחד ניתן לייעד באופן פוטנציאלי mRNAs מרובים, חשוב לקבל תצוגה לפי הקשר של פרופיל ביטוי miRNA כדי להבין את הערך של הפרט ואת השפעת miRNAs קולקטיבית. miRNAs הוכחו להיות מעורב B-cell פיתוח, בידול היקפיים, כמו גם בידול ספציפיות שלב B-cell נוגדנים בתגובה, מחלת חיסון עצמי1,4,9. 3' UTR של Aicda , Prdm1, ישנם מספר מאומתים או החזוי אבולוציונית שנשמרת אתרי ניתן לפלח מאת miRNAs8.
אפנון epigenetic, לרבות שינוי היסטון שעתוק שלאחר miRNAs, להציג דפוס ספציפיות שלב התקנה מסוג תא ותא של ביטוי גנים9. כאן, אנו מתארים שיטות כדי להגדיר את אפנון בתיווך HDI של miRNA ואת הביטוי mRNA, CSR, ו פלזמה תאית התמיינות. אלה כוללים את הפרוטוקולים עבור גרימת B תאים לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות; לטיפול תאי B עם HDI; עבור ניתוח miRNA והביטוי mRNA מאת לרביעיית-PCR miRNA-seq, mRNA-seq10,11,12,8,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:152px;">Jackson Labs</td>
			<td align="right" style="width:111px;">664</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT 10-040-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL</td>
			<td>Fisher Scientific - Hyclone</td>
			<td>SV3007901&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21008-952&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Stain 0.04%</td>
			<td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td>
			<td align="right">15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW10-548E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:528px;">EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td align="right">18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Mouse B cell Isolation Kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td align="right">19854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>&#160;305199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>142513 (25 ug)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7 B220 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td align="right">103222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD (1 mg)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9400-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">103212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse APC-IgG1 200 &#181;g</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">406610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse IgM Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">406506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">103206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">103208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS 1X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-21-022-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2880-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant mouse IL-4 (carrier-free)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>574302 (size: 10 ug)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-5Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-538-59A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL Microtube, clear</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>22-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELMI SkySpin CM-6MT</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>CM-6MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotor 6M</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotor 6M.06</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>6M.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 mL serological pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mL serological pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL serological pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>898130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">366802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">366650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">368298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Direct-zol RNA MiniPrep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free Dnase set (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">175013897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad&#160;</td>
			<td>172-5121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:111px;">14-230-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal &#39;B&#39; Adhesive Seals</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyiQ Optics Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-9744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCycler Chassis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-9752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSR II Flow Cytometry Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo 10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2943CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S200 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPRIworks Fragment Library System I for Illumina</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A288267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cBot Cluster Generation Station</td>
			<td>illumina</td>
			<td>SY-312-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HiSeq 2000 Genome Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3</td>
			<td>Bioo Scientific</td>
			<td>5132-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2200 TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2964AA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of hdac inhibitor-mediated modulation of micrornas and mrnas in b cells induced to undergo class-switch dna recombination and plasma cell differentiation

תגובות נוגדנים מוכשרות דרך מספר תהליכי תא B קריטי-מהותי, לרבות היפרמוטציה (SHM), מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) התמיינות תאים פלזמה. בשנים האחרונות שינויים epigenetic או גורמים, כגון היסטון deacetylation מיקרו Rna (miRNAs), הוכחו אינטראקציה עם תוכניות גנטי B-cell לעיצוב תגובות נוגדנים, בעוד כבר מצאו את תפקוד של גורמים epigenetic להוביל נוגדן עצמי תגובות. ניתוח miRNA הגנום כולו והביטוי mRNA בתאים B בתגובה מאפננים epigenetic חשוב להבנת epigenetic ויסות התגובה נוגדן והפונקציה B-cell. . הנה, נדגים פרוטוקול גרימת B תאים לעבור התמיינות CSR ותא פלזמה, מתייחס האלו תאי B עם מעכבי היסטון deacetylase (HDAC) (HDIs), וניתוח mRNA microRNA הבעה. ב פרוטוקול זה, ננתח ישירות רצפי DNA (cDNA) משלימים באמצעות הדור הבא רצפי mRNA (mRNA-seq) וטכנולוגיות miRNA seq, מיפוי של הרצף מקריאה הגנום, ואת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית)-PCR. עם הגישות הללו הגדרנו, בתאי B המושרה לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות, HDI, הרגולטור epigenetic, באופן סלקטיבי ממיקרו miRNA והביטוי mRNA ומשנה בידול CSR ותא פלזמה.

באמצעות הפרוטוקול שלנו לטהר בתאי B להניח LPS (3 µg/mL) ו- IL-4 (5 ng/mL) עבור 96 h יכול לגרום 30-40% CSR כדי IgG1 ו ~ 10% של התמיינות תאים פלזמה. לאחר טיפול עם HDI (500µM VPA), נציג שירות הלקוחות כדי IgG1 ירד ל 10-20%, בעוד התמיינות תאים פלזמה ירד ל ~ 2% (איור 1). בתיווך HDI עיכוב של CSR אושר עוד יותר ע י מספר...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...