Name: genome-wide analysis of hdac inhibitor-mediated modulation of micrornas and mrnas in b cells induced to undergo class-switch dna recombination and plasma cell differentiation
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell

Эта работа была поддержана NIH грантов Ай 105813 и 079705 Ай (для ПК), Альянс для идентификации целевых исследований волчанки в Lupus Грант ALR 295955 (для ПК) и артрит, Национальный исследовательский фонд исследования Грант (в Гц). TS была поддержана педиатрии медицинский центр, второй Xiangya больницы, Центральный Южный университет, Чанша, Китай, в контексте программы посещения медицинских студент Xiangya-UT школа медицины Сан-Антонио.

протокол руководящими животных ухода институциональный уход животных и использование комитетов в университете центра науки здоровья Техас в Сан-Антонио.
 1. стимуляции B клетки мыши для КСО, дифференцировки клеток плазмы и ИРЧП лечения <ol><li>приготовления суспензий...

<ol>
	<li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control.">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li><li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+of+the+antibody+response.">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).</li><li>Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+of+Peripheral+B-Cell+Differentiation+and+the+Antibody+Response.">Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response.</a> Front Immunol. 6, 631 (2015).</li><li>Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+class-switch+DNA+recombination:+induction,+targeting+and+beyond.">Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+upregulate+B+cell+microRNAs+that+silence+AID+and+Blimp-1+expression+for+epigenetic+modulation+of+antibody+and+autoantibody+responses.">Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses.</a> J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).</li><li>Farh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+fine+mapping+of+causal+autoimmune+disease+variants.">Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants.</a> Nature. 518, 337-343 (2015).</li><li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis.">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).</li><li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform.">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).</li><li>Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+selective+modulation+of+microRNAs+and+mRNAs+by+histone+deacetylase+inhibitor+in+B+cells+induced+to+uUndergo+class-switch+DNA+recombination+and+plasma+cell+differentiation.">Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation.</a> Front. Immunol. 6, 627 (2015).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Kin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fRNAdb:+a+platform+for+mining/annotating+functional+RNA+candidates+from+non-coding+RNA+sequences.">fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).</li><li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs.">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=doRiNA:+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation.">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li></ol>

Этот протокол обеспечивает всеобъемлющие подходы к заставить клетки B класса переключения и дифференцировки клеток плазмы; для анализа их воздействия на эпигеномный модуляторы, а именно ИРЧП; и обнаружить влияние ИРЧП на мРНК и Мирна выражение в этих клетках. Большинство из этих подхо?...

Эпигенетических меток или факторов, таких как метилирование ДНК, Посттрансляционная изменения гистона и РНК-кодирования (включая микроРНК), модулировать функции клеток путем изменения выражения гена1. Эпигенетические модификации регулировать функции лимфоцитов, например иммуноглобулинов класса переключатель рекомбинации ДНК (КСО), соматические Гипермутационный (ГИМ) и дифференциации в памяти B клетки или клетки плазмы, таким образом модулируя антитела и аутоантитела ответы2,3. КСО и SHM критически требуют активации индуцированной Цитидин Аденозиндеминазный (помощь, кодируются как Aicda), который высоко индуцируется в B клеток в ответ на Т-зависимых и T-независимая антигены4. Класс включен/hypermutated клетки B Далее дифференцироваться в плазматические клетки, которые выделяют большое количество антител в значительной степени зависит от созревания лимфоцитов индуцированного белка моды 1 (Blimp1, кодируются как Prdm1)5. Аномальные эпигеномные изменения в клетках B может привести к аномальным антитела/аутоантител ответы, которые могут привести к аллергической реакции или Аутоиммунная реакция1,4. Понимание как эпигенетических факторов, таких как адаптивной, модулировать клетки B встроенные выражения гена важно не только для разработки вакцины, но важно также выявить механизмы потенциальной реакции ненормальные антител/аутоантител.
Ацетилирование гистона и диацетилморфина являются модификациями остатков лизина на гистоны обычно катализируемой гистона ацетилтрансфераза (ШЛЯПУ) и гистоновых деацетилаз (ГДАЦ). Эти изменения приводят к рост или снижение доступности хроматина и далее разрешить или запретить связывание транскрипционных факторов или белки ДНК и изменением ген выражение5,6, 7 , 8. ингибиторы ГДАЦ (ИРЧП) являются класс соединений, которые вмешиваются с функцией гда. Здесь мы использовали HDI (VPA) для решения регулирование HDAC на профиль выражение внутренней гена B клеток и его механизм.
интерферирующим являются маленькие, -кодирования RNAs приблизительно 18-22 нуклеотидов в длину, создаваемые через несколько этапов. Мирна хост генов являются расшифрованный и формируют шпилька первичной микроРНК (pri адаптивной). Они экспортируются в цитоплазму, где pri адаптивной Далее перерабатывается в адаптивной прекурсоров (pre адаптивной). Наконец зрелый интерферирующим образуются путем расщепления pre адаптивной. интерферирующим признают взаимодополняющие последовательности в 3' непереведенные регионе их целевой mRNAs6,7. Через post-transcriptional глушителей, адаптивной регулировать клеточную активность, например распространение, дифференциация и апоптоз10,11. Поскольку несколько интерферирующим можно ориентировать же мРНК, а один единый Мирна потенциально может предназначаться нескольких мРНК, важно иметь представление в контексте выражение профиля Мирна понять значение человеческой личности и коллективный эффект адаптивной. интерферирующим было показано, быть вовлечены в развитие B-клеток периферической дифференциации, а также B-клеточной стадии конкретных дифференциации, реакции антитела и аутоиммунные заболевания1,4,9. В 3' УТР Aicda и Prdm1есть несколько проверенных или прогнозируемых эволюционно сохранены сайтов, которые могут быть объектом интерферирующим8.
Эпигеномные модуляции, включая изменения гистона после транскрипции и адаптивной, отображать шаблон типа клеток и клеток стадии конкретных правил выражение гена9. Здесь мы описываем методы для определения HDI-опосредованной модуляции Мирна и выражение mRNA, КСО и дифференцировки клеток плазмы. К ним относятся протоколы для заставить клетки B пройти КСО и дифференцировки клеток плазмы; для лечения клетки B с ИРЧП; и для анализа Мирна и мРНК выражение qRT-PCR, Мирна seq и мРНК seq10,11,12,8,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:152px;">Jackson Labs</td>
			<td align="right" style="width:111px;">664</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT 10-040-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL</td>
			<td>Fisher Scientific - Hyclone</td>
			<td>SV3007901&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-420-3250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21008-952&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Stain 0.04%</td>
			<td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td>
			<td align="right">15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW10-548E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:528px;">EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td align="right">18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Mouse B cell Isolation Kit</td>
			<td>Stem Cell Tech</td>
			<td align="right">19854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>&#160;305199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody</td>
			<td>BioLegend&#160;</td>
			<td>142513 (25 ug)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy7 B220 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td align="right">103222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD (1 mg)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9400-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">103212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse APC-IgG1 200 &#181;g</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">406610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse IgM Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">406506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">103206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">103208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS 1X</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-21-022-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2880-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant mouse IL-4 (carrier-free)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>574302 (size: 10 ug)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Valproic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-5Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-538-59A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL Microtube, clear</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>22-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELMI SkySpin CM-6MT</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>CM-6MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotor 6M</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotor 6M.06</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>6M.06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 mL serological pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89130-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mL serological pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL serological pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>898130-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">366802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">366650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">368298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Direct-zol RNA MiniPrep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free Dnase set (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td align="right">79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop 2000 Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">175013897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad&#160;</td>
			<td>172-5121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:111px;">14-230-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal &#39;B&#39; Adhesive Seals</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyiQ Optics Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-9744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iCycler Chassis</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-9752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSR II Flow Cytometry Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo 10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2943CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S200 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPRIworks Fragment Library System I for Illumina</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A288267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cBot Cluster Generation Station</td>
			<td>illumina</td>
			<td>SY-312-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HiSeq 2000 Genome Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3</td>
			<td>Bioo Scientific</td>
			<td>5132-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2200 TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2964AA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide analysis of hdac inhibitor-mediated modulation of micrornas and mrnas in b cells induced to undergo class-switch dna recombination and plasma cell differentiation

Антитело ответы выполняются через несколько критических клетки B внутренние процессы, включая соматических Гипермутационный (ГИМ), класс переключатель рекомбинации ДНК (КСО) и дифференцировки клеток плазмы. В последние годы эпигеномные изменения или факторов, таких как гистона диацетилморфина и микроРНК (интерферирующим), было показано взаимодействовать с B-клетки генетических программах ответов антитела форму, в то время, как было установлено, что дисфункция эпигенетических факторов приводят к аутоантитела ответы. Анализ генома общесистемной Мирна и мРНК выражение в B клеток в ответ на эпигеномный модуляторы имеет важное значение для понимания эпигеномные регулирование B-клеточной функции и антител реакции. Здесь мы демонстрируем протокол для заставить клетки B пройти КСО и плазматических клеток дифференциации, рассматривая эти клетки с Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) (ГУВБ) и анализа выражение mRNA и микроРНК. В этом протоколе, мы непосредственно анализировать дополнительные ДНК — (cDNA кДНК) последовательности, используя последовательность мРНК следующего поколения (мРНК seq) и Мирна seq технологий, картирование секвенирования читает генома и количественная обратная транскрипция (qRT)-PCR. С этими подходами мы определили, что в индуцированной пройти КСО и дифференцировки клеток плазмы клетки B, ИРЧП, эпигенетических регулятор, выборочно модулирует Мирна и мРНК выражения и изменяет КСО и плазматических клеток дифференциации.

С помощью нашего протокола, очищенный клетки B с ПЛАСТИНОК (3 мкг/мл) и Ил-4 (5 нг/мл) за 96 ч может вызвать 30-40% КСО для IgG1 и ~ 10% дифференцировки клеток плазмы. После лечения с HDI (500µM VPA), КСО для IgG1 сократилось до 10-20%, а дифференцировки клеток плазмы снизилась до ~ 2% (рис. 1)</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Эпигенетических факторов может взаимодействовать с генетической программы модуляции экспрессии генов и регулировать функции B клеток. Объединив в vitro клетки B стимуляции, qRT-PCR и высок объём микроРНК последовательности и мРНК последовательность подходов, мы можем анализировать эпигеномные модуляции экспрессии Мирна и генов в клетки B.

Геном широкий анализ HDAC ингибиторов-опосредованной модуляция микроРНК и мРНК в B клетки вынуждены подвергаются класса переключатель рекомбинации ДНК и дифференцировки клеток плазмы

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

The overall goal of this experiment is to induce B lymphocytes to undergo antibody class-switching and plasma cell differentiation and analyze the modulation as well as epigenetic regulation by the expression of HDAC inhibitor mRNA and microRNA in B-cells. This method can help answer key questions in the B-cell antibody response field such as, epigenetic modulation of immunoglobulin class-switching and plasma cell differentiation. The main advantage of this technique is to provide a simple method to modulate B-cell functions and to define the alteration of microRNAs and mRNAs by epigenetic regulators.After euthanizing a specific pathogen-free C57BL6J mouse and sterilizing the skin according to the text protocol, use autoclaved forceps and dissecting scissors to cut through the skin just below the ribcage to visualize the spleen on the left side of the abdomen, just below the liver. Gently clamp the spleen and cut off all the connecting tissue before extracting the organ. Then place the spleen into a 1.5 milliliter microcentrifuge tube containing 1, 000 microliters of complete RPMI 1640 medium.Next, insert a 70 micron cell strainer into a 50 milliliter polypropylene conical centrifuge tube and pour the spleen from the microcentrifuge tube onto the cell strainer. Use the tip of a 15 milliliter polypropylene conical centrifuge tube to gently mesh the spleen through the strainer. Then with 15 to 20 milliliters of complete medium, rinse the strainer.Spin down the cells at 350 x G for five minutes. Discard the supernatant. Use one milliliter of ACK lysis buffer to re-suspend the cell pellet and incubate for one minute.Then add four milliliters of ACK and incubate the suspension to remove red blood cells from the spleen suspension for an additional four minutes at room temperature with occasional shaking. Then add 25 milliliters of complete medium to quench the lysis reaction. Spin down the cells at 350 x G for five minutes.Discard the supernatant and add one milliliters of complete medium to re-suspend the cell pellet. Then using a hemocytometer, count the viable cells. In a sterile five milliliter polystyrene round bottom tube, prepare a 0.25 to two milliliter cell suspension of 1 x 10 to the 8th cells per milliliter in complete medium.Add normal rat serum to the sample. Next, add 50 microliters per milliliter of isolation cocktail to the tube. Then mix the cells by gently pipetting up and down two to three times and incubate the sample at room temperature for 10 minutes.Add 75 microliters per milliliter of streptavidin encoated magnetic particles to the tube. Gently pipette up and down two to three times and incubate the sample at room temperature for two and a half minutes. Bring the volume up to 2.5 milliliters using complete RPMI 1640 medium and gently pipette two to three times to mix.Place the opened tube into the magnet and incubate it at room temperature for two and a half minutes. Then pour off the supernatant containing untouched B-cells into a new 15 milliliter conical tube. Use trypan blue and a hemocytometer to count the cells.Re-suspend the purified B-cells in complete RPMI 1640 medium at a final concentration of 0.3 x 10 to the 6th cells per milliliter. Then, to the wells of a 48 well plate, add one milliliter of purified B-cells at a 0.3 x 10 to the 6th cells per milliliter three microgram per milliliter of LPS from E.Coli, five nanogram per milliliter of IL4 and either zero or 500 micromolar HDI. Incubate the cells at 37 degree celsius and 5%carbon dioxide for 60 hours for QRT PCR and high throughput mRNA and miRNA sequencing analysis or 96 hours for flow cytometry analysis.After 96 hours of culture, detach the cells from each well by pipetting them up and down several times. Transfer the cell suspension into a 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Then, using a bench top centrifuge, spin down the cells at 350 x G for five minutes.Then, discard the supernatant. Mix a cocktail of HBSS buffer and the following reagents, 1%BSA, 0.5 nanograms per milliliter of conjugated goat anti-mouse IgM antibody, 0.2 nanograms per milliliter of conjugated rat anti-mouse IgG1 monoclonal antibody, 0.2 nanograms per milliliter of conjugated rat anti-mouse B220 monoclonal antibody, 0.2 nanograms per milliliter of PE-Cy7-conjugated rat anti-mouse CD138 monoclonal antibody and two nanograms per milliliter of 7-AAD. Incubate the cells in the dark at room temperature for 30 minutes.Then use one milliliter of HBSS with 1%BSA to wash the cells. Use a bench top centrifuge to spin down the cells at 1, 500 x G for five minutes. After discarding the supernatant, use 300 microliters of HBSS with 1%BSA to re-suspend the cells and transfer the cell suspension to a round bottom polystyrene tube.Cover the tube with foil to avoid light exposure. To carry out QRT PCR analysis of mRNA, include the DNAse 1 treatment step. Then, use a commercial total RNA isolation kit that can recover small RNA to extract RNA from 0.2 to 5 x 10 to the 6th cells, following the manufacturer's instructions.After synthesizing cDNA and performing QRT PCR on the mRNA, carry out RT PCR for microRNA using a cyber green real time PCR master mix by thawing at room temperature, 2x PCR master mix, 250 nanomolar miRNA specific forward primer and a universal reverse primer. After preparing a 25 microliter reaction mix according to the text protocol, add 22.5 microliter aliquots per well to a 96 well PCR plate. Then, add 2.5 microliters of template cDNA to the individual wells.Tightly seal the plate film. Then centrifuge the plate at 1, 000 x G at room temperature for one minute. Place the plate in the real time cycler and start the cycling program found in the text protocol.Using the protocol demonstrated in this video, purified B-cells incubated without PS NIL4 for 96 hours can induce 30 to 40%of CSR to IgG1 and approximately 10%of plasma cell differentiation. After treatment with HDI, the CSR to IgG1 decreased to 10 to 20%while plasma cell differentiation decreased to approximately 2%HDI mediated inhibition of CSR was further confirmed by decreased numbers of post-recombination I mu C gamma 1 and mature VHDJHC gamma 1 transcripts. As measured by QRT PCR, the expression of Aicda which is critical for CSR SHM and Prdm1 and Xbp1, which are important for plasma cell differentiation were shown to be inhibited by VPA.As measured by mRNA sequencing of B-cells stimulated without PS Nil4, only 0.3%of these highly expressed mRNAs were upregulated by HDI more than two fold and only 0.36%of the highly expressed mRNAs, including Aicda, Prdm1 and Xbp1 were reduced by HDI more than 50%The miRNA sequencing analysis of miRNA profiling in B-cells treated with HDI or Nil, showed that HDIs selectively upregulate Aicda and Prdm1 targeting miRNAs. Once mastered, this technique can be done in four and half to five hours. While attempting this procedure, it is important to remember to keep a sterile work environment.After watching this video, you should have a good understanding of how to induce B-cells to undergo class-switching and plasma cell differentiation and to modulate these functions by epigenetic regulators.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Индукция и оценка класса Рекомбинация коммутатор в Очищенная мышиные клетки B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Быстрое Молекулярная Обнаружение и дифференциация вирусов гриппа А и В

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...