Name: in utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00
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Wir danken R. Gutiérrez und A. Morales für ihre hervorragende technische Unterstützung und LA Weiss für die Bearbeitung. CGB wird von der spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011 finanziert. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von BBVA-Stiftung und SAF2014-58598-jin (Mineco) M. Navarrete und durch einen Zuschuss aus dem Ramón Areces Stiftung und Zuschüsse SAF2014-52119-R und BFU2014-55738-REDT finanziert (von Mineco) zu M. Nieto.

(; PROEX 331/15 PROEX 118/14) Alle Tier Verfahren wurden von der Gemeinschaft von Madrid Animal Care und Use Committee, in Übereinstimmung mit den nationalen und europäischen Gesetzgebung zugelassen. Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während des Verfahrens. 1. In Utero Elektroporation Hinweis: Dieses Protokoll für IUE wird von den anderen angepaßt , die zuvor veröffentlicht wurden 5, 6,</...

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	<li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch.">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li><li>Rodriguez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II/III+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing.">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+postnatal+electroporation+and+time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+mouse+acute+brain+slices.">In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Woodworth, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip1+Regulates+the+Balance+between+Specification+of+Distinct+Projection+Neuron+Subtypes+in+Deep+Cortical+Layers.">Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers.</a> Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single,+genetically+targeted+neurons.">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transportable,+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation.">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li><li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons.">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li><li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons.">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li><li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone.">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li><li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons.">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2/3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex.">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li><li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage.">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie Neuronen des somatosensorischen Kortex von C75BL / 6-Mäuse zu beschriften, um ihre Verbindungen und ihre Erregbarkeit zu analysieren. In Bezug auf die bestehenden Methoden, visualisiert sie diskriminierende Aspekte der Konnektivität, wie die Anzahl der axonalen Verzweigungen pro Neuron, ihre genaue Topographie und ihrer anatomischen Lage. Durch Veränderung der Position der Elektroden, ist es möglich , andere Neuronenpopulationen, wie beispielsweise die cingulären Cortex zu...

Die Entwicklung von dendritischen und axonalen Strukturen ist ein wichtiger Aspekt der Schaltungsregelung im Nervensystem, in der Großhirnrinde einschließlich. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der selektiven Verdrahtung der verschiedenen neuronalen Subpopulationen. Eine Anzahl von jüngsten Berichte haben gezeigt, dass, zusätzlich zu Verbindungen, die molekulare Vielfalt von Neuronen wird durch die Übernahme von hochspezifischen Modi des Brennens reflektiert. Die Mechanismen , die Erregbarkeit und Konnektivität der verschiedenen neuronalen Subtypen während der Entwicklung, sowie ihre Koordinationsgrad zu bestimmen, sind jedoch immer noch schlecht verstanden , 1, 2. In vivo Verlust- und gain-of-function Analysen zur Untersuchung der Beziehung zwischen der Expression von spezifischen Genen und deren Einfluss auf die Entwicklung der Schaltung ermöglichen. In utero Elektroporation (IUE) ist eine Technik weit verbreitet zu studierendie Funktion eines Gens von Interesse in spezifischen neuronalen Populationen und die Gesamtmuster ihrer Verbindungen zu studieren. Um jedoch die morphologischen Eigenschaften von Axonen und Dendriten in kortikalen Schichten in lebenden Mäusen zu bestimmen, ist es wichtig, Neuronen dünn zu beschriften. Eine Cre-Rekombinationssystem mit IUE kombiniert verwendet werden, um ein Sparse-Population von Neuronen bei einer ausreichend niedrigen Dichte zu markieren die Vorsprünge durch einzelne Zellen der identifizierten kortikalen laminas emittiert zu lösen. Diese Methode Etiketten eine ausreichende Anzahl von Neuronen pro Kortex quantitative Daten nach der Analyse der angemessenen Anzahl von elektroporiert Gehirne (Abbildung 1) zu erhalten. Dieses Manuskript stellt eine Methode für eine solche Feinanalyse der Konnektivität. Es stellt auch eine ähnliche Strategie zu analysieren, in getrennten Experimenten, die elektrischen Eigenschaften von Neuronen, die durch Strom-Clamp-Aufnahmen auf grün fluoreszierendes Protein Durchführung (GFP) -electroporated Zellen aus akuten kortikalen Scheiben schneiden. Diese proTocole sind vielseitig und können zur Untersuchung der Erregbarkeit und Konnektivität von Neuronen durch zusätzliche Plasmide während IUE WT und transgenen Tieren und auch von Neuronen in denen Verluste und Gewinne von Funktions eingeführt angewendet werden. Obwohl dieses Protokoll kann die Elektroporation von Mäusen an embryonalen Tag (E) 15.5, diese Technik durchgeführt zwischen E9.5 3 und postnatalen Tag (P) 2 4 in jedem Alter werden beschrieben. Während der Elektroporation in frühen Stadien zielt Neuronen und Vorstufen des Thalamus und tiefen Schichten der Hirnrinde, späteren Stufe der Elektroporation Markierungen oberflächlicher Schichten (zB E15.5 IUE Ziele Schicht II-III Neuronen). Zusammenfassend ist die Kombination von IUE mit Einzelzell morphologische Analyse und die Elektro ein nützliches Werkzeug, um die molekularen Mechanismen, die die enorme strukturelle und funktionelle Vielfalt von Neuronen im Nervensystem zu erläutern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pCAG-Cre</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13775</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCALNL-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>15777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>301.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen (Rimadyl)</td>
			<td>Pfizer GmbH</td>
			<td>1615 ESP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (IsoFlo)</td>
			<td>Abbott (Esteve)</td>
			<td>1385 ESP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Imalgene)</td>
			<td>Merial</td>
			<td>2528-ESP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xilagesic)</td>
			<td>Calier</td>
			<td>0682-ESP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine</td>
			<td>Meda</td>
			<td>694109.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment (Lipolac)</td>
			<td>Angelini</td>
			<td>65.277</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>24020-091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3 - 12cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1106-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors - Straight &#160; 11 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm</td>
			<td>Teleflex</td>
			<td>PO143281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin curved tips - Style 7 Dumoxel</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0303-7-PO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mathieu Needle Holder - Serrated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12010-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip Applier</td>
			<td>Braintree scientific, Inc</td>
			<td>ACS&#160;APL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm AutoClips</td>
			<td>MikRon Precision, Inc.</td>
			<td>205016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures - Polysorb 6-0</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>UL-101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor&#160;</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>ER 240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter)</td>
			<td>Wold Precision Instrument Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze (Aposan)</td>
			<td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td>
			<td>C.N. 482232.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs (Star Cott)</td>
			<td>Albasa</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25G (BD Microlance 3)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>300600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>158127</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator ECM 830&#160;</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes 650P 7 mm</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CUY650P7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;for Fluorescent Imaging - MZ10F</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP 3000 Isofluorane Vaporizer</td>
			<td>Matrx</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SP5 Laser Scanning System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - CM 1950</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Micropette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>DD1440A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator + Rotating Base&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Table</td>
			<td>Newport</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Peristaltic Pumps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity

Das Nervensystem besteht aus einer enormen Bandbreite von verschiedenen neuronalen Typen zusammen. Diese neuronalen Subpopulationen sind gekennzeichnet durch, unter anderen Merkmalen, ihre unterschiedlichen dendritischen Morphologien, ihre spezifische Muster von axonalen Konnektivität und deren selektive Brennen Antworten. Die molekularen und zellulären Mechanismen, die für diese Aspekte der Differenzierung während der Entwicklung sind immer noch schlecht verstanden. Hier beschreiben wir kombinierte Protokolle für die Kennzeichnung und die Charakterisierung der strukturellen Verbindungen und Erregbarkeit der Neurone. Die Modifikation der in utero Elektroporation (IUE) Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einer spärlichen Population von Neuronen. Dies wiederum ermöglicht die Identifizierung und Verfolgung der Dendriten und Axone der einzelnen Neuronen, die genaue Charakterisierung der laminaren Lage von axonalen Projektionen und morphometrische Analyse. IUE kann auch in der Erregbarkeit zu untersuchen Veränderungen verwendet werden vonWildtyp (WT) oder gentechnisch veränderten Neuronen indem sie sie mit Ganzzell-Aufnahme von einer akuten Scheiben durch Elektroporation Gehirne zu kombinieren. Diese beiden Techniken tragen zu einem besseren Verständnis der Kopplung von strukturellen und funktionalen Verbindungen und der molekularen Mechanismen der neuronalen Steuerung Vielfalt während der Entwicklung. Diese Entwicklungsprozesse haben wichtige Auswirkungen auf axonalen Verkabelung, die funktionelle Diversität von Neuronen und die Biologie von kognitiven Störungen.

Um die morphologischen Veränderungen von Neuronen im Detail zu charakterisieren und während der Entwicklung ist es wesentlich Neuronen dünn zu etikettieren. Ein Cre-Rekombinase verdünnt System ermöglicht die Expression eines Gens von Interesse in einer spärlichen Population von Neuronen, so dass nur solche Neuronen , die dieses Enzym exprimieren GFP (1A) integrieren. Mit dieser Strategie Schicht II-III wird gezielt und von IUE bei E15.5 gekennzeichnet. CAG-DsRed2 b...

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In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

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Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...