Name: detection of copy number alterations using single cell sequencing
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00
Duration: 9 min 45 s
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Nous remercions Stuart Levine pour les commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grant GM056800 et Kathy et Curt Marble Cancer Research Fund à Angelika Amon et en partie par l&#39;Institut Koch de soutien Grant P30-CA14051. Angelika Amon est aussi un enquêteur du Howard Hughes Medical Institute et la Fondation Glenn pour la recherche biomédicale. KAK est soutenu par le NIGMS Training Grant T32GM007753.

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Traditionnellement, l&#39;identification CNV et aneuploïdie au niveau des cellules individuelles requises méthodes cytologiques telles que FISH et SKY. Maintenant, le séquençage de la cellule unique a émergé comme une approche alternative pour ces questions. séquençage cellulaire unique a des avantages sur FISH et SKY car il est à la fois l&#39;ensemble du génome et de haute résolution. En outre, lorsque les méthodes de contrôle de la qualité appropriées sont appliquées, le séquençage de la cellule unique peut fournir une évaluation plus fiable du CNV et aneuploïdie comme il est pas sensible aux artefacts d&#39;hybridation et de propagation inhérents à FISH et SKY. Cependant, la plupart des applications récentes de séquençage de la cellule unique ne sont pas étayées par une évaluation approfondie de la sensibilité et la spécificité des méthodes et des analyses. En effet, certaines des approches analytiques utilisées par d&#39; autres études sont associés à des fréquences élevées (&gt; 50%) des faux positifs CNV appelle 12. L&#39;approche que nous décrivons a été rigoureusement testé en utilisant des cellules de knpropre fardeau CNV afin de déterminer les taux de découverte vrais et faux et d&#39; optimiser la sensibilité et la spécificité de la détection CNV 12. Utilisation du contrôle de la qualité et des approches analytiques décrites dans ce protocole, environ 20% des 5 gains Mb, 75% de 5 défaites Mb, et tout CNV dépassant 10 Mb peut être détectée. Bien que la détermination du taux de fausse découverte du séquençage d&#39;une seule cellule est difficile, nous avons estimé qu&#39;il soit inférieur à 25%. Ce protocole peut être appliqué à des cellules d&#39;une variété de sources, les scripts peuvent être modifiées pour ajuster la résolution de la détection NVC, ainsi que le protocole peut être adapté pour identifier d&#39;autres types d&#39;altérations génomiques. Il existe une variété de moyens de dissociation de tissus frais dans des cellules individuelles, et de nombreuses publications décrivent les procédures optimisées pour des tissus spécifiques, tels que la peau et le cerveau 24 25. Nous préférons pour isoler des cellules uniques par microaspiration car elle permet fo<html> r évaluation visuelle de chaque cellule à séquencer. Cependant, il est également possible d&#39;isoler des cellules uniques par fluorescence activée par tri cellulaire (FACS) 26 et 27 des dispositifs microfluidiques. Si l&#39;isolement d&#39;une cellule unique et l&#39;amplification du génome entier est effectuée manuellement, il est raisonnable d&#39;isoler et d&#39;amplifier jusqu&#39;à quarante cellules en une seule séance. Afin d&#39;obtenir des données de séquençage d&#39;une cellule unique de haute qualité, il est crucial que l&#39;amplification des génomes de cellules uniques est uniforme et complète. Nous constatons que la qualité des cellules individuelles isolées, ainsi que l&#39;efficacité de la lyse et l&#39;amplification a un impact significatif sur la qualité des données de séquençage. Par conséquent, les cellules doivent être récoltées à partir de leur environnement naturel, juste avant l&#39;isolement et l&#39;amplification du génome entier devrait commencer immédiatement après que les cellules sont isolées. En outre, l&#39;étape de lyse et de la fragmentation doit être suivie exactement comme décrit dans les étapes 2.3-2.6. &quot;&gt; Les algorithmes peuvent être ajustés pour changer la résolution de la détection CNV, avec des effets sur la sensibilité et la spécificité 12 opposées. Il est également possible d&#39;ajuster les seuils pour détecter l&#39; ensemble du chromosome aneuploïdie dans le cadre de tétraploïdie 11. Cependant, nous constatons que notre approche est limitée à la détection CNV supérieure à 5 Mb, comme le bruit introduit lors de l&#39; amplification du génome entier complique la détection de petites variantes 12. les améliorations futures dans les approches d&#39;amplification du génome entier devraient finalement augmenter la résolution de la détection CNV utilisant le séquençage d&#39;une seule cellule. Séquençage cellulaire unique permet une enquête non seulement des modifications du nombre de copies , mais aussi des variations de nucléotides simples 28, 29 et variation structurelle 30. Notre protocole d&#39;isolement d&#39;une cellule unique peut être appliqué pour répondre à ces autres Questions. Cependant, le choix de la méthode d&#39;amplification du génome entier dépend de l&#39;application spécifique. La méthode décrite dans ce protocole, qui est basé sur la réaction en chaîne de la polymérase, est le mieux adapté pour détecter le nombre de copies des modifications car elle est associée à des niveaux inférieurs de polarisation d&#39;amplification 32. Pour étudier d&#39; autres types d&#39;altérations génomiques, tels que des polymorphismes de nucléotides simples, d&#39; autres procédés d&#39;amplification du génome entier sont censés être plus appropriés 31, 32.

Les modifications du nombre de copies d&#39;ADN peuvent varier en taille de plusieurs paires de bases (nombre de copies variantes) (CNV) à des chromosomes entiers (aneuploïdie). Modifications du nombre de copies qui affectent les grandes régions du génome peuvent avoir des conséquences importantes phénotypiques en modifiant l&#39;expression de jusqu&#39;à des milliers de gènes 1, 2. CNV qui sont présents dans toutes les cellules d&#39;une population peut être détectée par un séquençage en masse ou des méthodes basées sur microréseaux 3, 4. Cependant, les populations peuvent également être génétiquement hétérogène, avec CNV existant dans un sous-ensemble de la population ou même des cellules individuelles. Hétérogénéité génétique est fréquente dans le cancer, entraînant l&#39; évolution de la tumeur et également présent dans les tissus normaux, avec des conséquences inconnues 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Traditionnellement, l&#39;hétérogénéité génétique a été évaluée soit par des approches cytologiques ou séquençage en vrac. Approches cytologiques, telles que l&#39; hybridation fluorescente in situ (FISH), les écarts de chromosomes, et caryotype spectral (SKY) dans, ont l&#39;avantage d&#39;identifier les altérations présentes dans les cellules individuelles , mais ont des taux d&#39;erreur élevés dus à des artefacts d&#39;hybridation et de propagation 11. Ces approches sont également limitées dans leur nombre de copies résolution uniquement révélant des changements sur plusieurs mégabases. Séquençage ou microarrays d&#39;ADN en vrac, bien plus élevé dans la précision et la résolution, est moins sensible. Afin de détecter l&#39;hétérogénéité génétique par des approches basées sur la population, les variantes doivent être présents dans une fraction substantielle des cellules dans la population. L&#39;émergence des procédés pour amplifier l&#39;ADN génomique à partir de cellules individuelles a permis de séquencer le génome des cellules individuelles. Seule cellule sequencing présente les avantages de haute résolution, haute sensibilité, et, lorsque les méthodes de contrôle de la qualité appropriées sont appliquées, de haute précision 12. Ici, nous décrivons un procédé de détection mégabases échelle du nombre de copies des altérations dans des cellules individuelles. Nous isolons des cellules individuelles par microaspiration, amplifier l&#39;ADN génomique en utilisant linker-adaptateur PCR, préparer des banques pour le séquençage de prochaine génération, et de détecter le nombre de copies des variantes à la fois par le modèle de Markov caché et la segmentation circulaire binaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing (ID 3/16&#34;, OD 5/16&#34;, ~1 foot)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing (ID 5/16&#34;, OD 7/16&#34;, ~6 inches)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 um)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28144-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (5 ml)</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-2837-5</td>
			<td>Any plastic 5 mL pipette should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Water Trap for Oxygen Use</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>700220210813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34502-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470156-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell&#160;Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR&#160;Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td>Any 96-well PCR plate should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-081</td>
			<td>Any 96-well tissue culture plate should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSA5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini plate spinner</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1225Z37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096&#160;</td>
			<td>Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Ampure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Any similar magnetic tube strip should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4845&#160;</td>
			<td>This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of copy number alterations using single cell sequencing

Détection des changements génomiques à la résolution de la cellule unique est important pour la caractérisation de l&#39;hétérogénéité génétique et l&#39;évolution dans les tissus normaux, les cancers et les populations microbiennes. Les méthodes classiques d&#39;évaluation de l&#39;hétérogénéité génétique a été limitée par la faible résolution, la faible sensibilité et / ou une faible spécificité. séquençage cellulaire unique a émergé comme un outil puissant pour détecter l&#39;hétérogénéité génétique avec une haute résolution, une sensibilité élevée et, lorsqu&#39;elles sont analysées de manière appropriée, une spécificité élevée. Ici, nous fournissons un protocole pour l&#39;isolement, l&#39;amplification du génome complet, le séquençage et l&#39;analyse des cellules individuelles. Notre approche permet l&#39;identification fiable des variantes du nombre de copies megabase échelle dans des cellules individuelles. Cependant, certains aspects de ce protocole peuvent également être appliquées pour enquêter sur d&#39;autres types d&#39;altérations génétiques dans des cellules individuelles.

L&#39;aspirateur assemblé doit ressembler à celle de la figure 1A. L&#39;aiguille doit être établie de telle sorte qu&#39;elle est suffisamment large pour accueillir une seule cellule, mais pas si grand qu&#39;un volume est établi avec la cellule unique. Aspiration des cellules individuelles est plus facile quand il y a entre un et cinq cellules dans un champ 10X (figure 1B). Si l&#39; amplification du génome entier est réussie, l&#39;échantillon apparaîtra comme un frottis sur un gel d&#39; agarose (figure 2, lignes 1, 2, 4, 5, 6 et 7). Un frottis faible ou absent indique une réaction d&#39;amplification a échoué et l&#39;échantillon ne doit pas être séquencée (figure 2, pistes 3 et 8). Après la préparation de bibliothèque, la distribution de la taille des fragments des échantillons doit être évalué par électrophorèse capillaire sur un analyseur de fragment.Avec succès les bibliothèques préparées ont une distribution plutôt même des tailles de fragment de 150 à 900 pb (figure 3, A, B). Préparation de la bibliothèque Échec se traduira par une distribution asymétrique de la taille des fragments et ces bibliothèques ne doit pas être séquencés (figure 3C). Le traitement des données de séquençage au moyen du modèle de Markov caché (HMMcopy) et segmentation binaire circulaire (DNAcopy) va analyser le génome de chaque cellule en segments d&#39;un nombre de copies estimé. Ces segments peuvent ensuite être filtrés pour identifier ceux avec un nombre de copies estimé compatible avec le gain ou la perte d&#39;une seule cellule (tableau 1). Ces segments filtrés de HMMcopy et DNAcopy devraient ensuite être superposées pour identifier haute confiance CNV. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> Figure 1. isolement cellulaire unique. (<html> A) Une assemblée microaspirator. (B) champ A 10X montrant dissocié les cellules (flèches) et aiguille microaspirator (coin inférieur droit). Aspiration des cellules individuelles est plus facile quand il y a entre un et cinq cellules dans un champ 10X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> Figure 2. génome entier amplification. Agarose électrophorèse sur gel de 5 pi de produits entiers d&#39;amplification du génome. Les échantillons qui amplifient avec succès apparaîtra comme frottis lumineux de 100 pb à 1 kb (pistes 1, 2, 4, 5, 6 et 7) et peut être séquencée. Les échantillons qui n&#39;amplifient pas correctement produira des frottis faibles ou pas de frottis (voies 3 et 8) et ne doit pas être séquencés.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Figure 3. Préparation Bibliothèque. Les résultats représentatifs d&#39;un analyseur de fragment. Les graphiques montrent la taille des fragments (en pb) sur l&#39;axe X et les unités de fluorescence relative (RFU) sur l&#39;axe des ordonnées. A droite de chaque graphique est une voie de gel simulé. (A) Résultats pour un échantillon idéal, avec une répartition uniforme entre 150 et 900 pb et sans pics ou polarisation vers un côté coupants. Cet échantillon est acceptable pour le séquençage. (B) Les résultats d&#39;une échantillon correct, avec une distribution de taille biaisés vers des tailles de fragments inférieurs. Bien que ce soit pas optimal, l&#39;échantillon peut encore être séquencée. (C) Résultats d&#39;un échantillon a échoué, avec prédominance de petites tailles de fragments. Ceci est probablement dû à une incubation prolongée au cours de l&#39;étape de tagmentationpréparation de bibliothèque. Cet échantillon ne doit pas être séquencé. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Échantillon </td><td> Segment </td><td> Chr </td><td> Début </td><td> Fin </td><td> Etat </td><td> Médian </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> CHR8 </td><td> 144500001 </td><td> 146500000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67000001 </td><td> 134500000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> chr19 </td><td> 1 </td><td> 20000000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> Chry </td><td> 1 </td><td> 59500000 </td><td> 2 </td><td> -1,506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Échantillon </td><td> Chrom </td><td> Démarrer bin </td><td> Fin bin </td><td> Début </td><td> Fin </td><td> moyenne Seg </td><td> med Seg </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62612945 </td><td> 129971511 </td><td> 1.4688 </td><td> 0,157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28416392 </td><td> 1,4141 </td><td> 0,1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> CHRX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51659160 </td><td> 95343369 </td><td> 1.3548 </td><td> 0,1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> Chry </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23805358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0,3591 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Analyse des données. segments Filtré générés par HMMcopy et DNAcopy à partir d&#39;une seule cellule. Chevauchement ces deux résultats révèle un gain sur le chromosome 10 de 67 à 130 Mb ainsi qu&#39;un gain sur le chromosome 19 de 0 à 20 Mb. Nous avons constaté que les gains sur la partie proximale du chromosome 19 sont un artefact de séquençage d&#39;une seule cellule 12.

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

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