Name: detection of copy number alterations using single cell sequencing
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing at JoVE.com

Ringraziamo Stuart Levine dei commenti a questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant GM056800 e Kathy e Curt marmo Cancer Research Fund di Angelika Amon e in parte dalla Koch Institute sovvenzioni P30-CA14051. Angelika Amon è anche un ricercatore del Howard Hughes Medical Institute e la Fondazione Glenn per la ricerca biomedica. KAK è supportato dal NIGMS formazione di Grant T32GM007753.

1. isolare le cellule singole <ol><li> Preparare il microaspirator <ol><li> Rimuovere la fine di plastica trasparente dal gruppo del tubo di aspirazione e inserire l&#39;estremità più stretta in una estremità di un 1 piede lungo tubo in PVC con &quot;diametro interno 3/16. </li><li> Inserire l&#39;uscita di un filtro a siringa da 0,2 micron nell&#39;altra estremità del 1 piede lungo tubo in PVC con &quot;diametro interno 3/6. </li><li> Inserire l&#39;ingresso del filtro a siringa da 0,2 micron in una estremità di un 6 pollici di lunghezza tubo in PVC con &quot;diametro interno 5/16. </li><li> Opzionale: Tagliare il tubo da 6 pollici a lungo PVC con &quot;diametro interno 5/16 a metà e inserire un sifone in linea tra le due metà. </li><li> Rompere una pipetta da 5 ml in plastica sierologica al 1 ml laurea e inserire l&#39;estremità rotta nell&#39;estremità aperta del tubo in PVC con &quot;diametro interno 5/16. </li><li> Inserire l&#39;uscita della pipetta sierologica 5 mL di plastica nella estremità flessibile di un gruppo del tubo aspiratore (dove l&#39;estremità di plastica trasparenteera stato rimosso). </li><li> Per la conservazione, coprire il boccaglio rosso del gruppo del tubo di aspirazione con un tubo di plastica sterile. </li><li> Disegnare un capillare di vetro ad un diametro interno di 10-30 micron portando la metà del tubo in prossimità di un becco Bunsen e applicando tensione su entrambe le estremità del tubo. Rompere il tubo trafilato in mezzo per creare due potenziali aghi aspiratore. Ripetere questa operazione con diversi tubi in quanto solo alcuni tubi finirà con un diametro interno che è appropriato per la raccolta di singole cellule. </li><li> Per lo stoccaggio, posizionare due strisce di plastilina in una capsula di Petri 15 centimetri e fissare gli aghi di aspirazione attraverso le strisce. </li></ol></li><li> raccogliere le cellule <ol><li> Preparare una sospensione singola cella come appropriato per il tipo di cella e sperimentare. Ad esempio, per preparare cellule aderenti, come le linee umani fibroblasti cellule, le cellule di raccolta di cellule tripsinizzazione e trasferirli in un tubo conico contenente adeguato supporto. </li><li> Prima, durante, oopo preparazione della sospensione singola cella (a seconda di quanto tempo ci vuole per preparare la sospensione singola cella), impostare il cappuccio per tutta l&#39;amplificazione del genoma. <ol><li> Spruzzare lungo la superficie del cofano, scatole di punta della pipetta e puntali per pipette con il 10% di candeggina e asciugare con un tovagliolo di carta. Ripetere questa operazione con il 70% di etanolo. </li><li> Aggiungere 8 ml di acqua dal kit di amplificazione del genoma intero (WGA) a singoli pozzetti di una piastra di pozzetti 96 PCR, un pozzetto per ogni cella da sequenziare. Coprire il 96 pozzetti PCR con un coperchio da una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti e posto su ghiaccio. </li></ol></li><li> Aggiungere a 1000 cellule per 10 mL media o tampone fosfato (PBS) in una piastra Petri 15 cm e posizionare il piatto sul ghiaccio per impedire alle cellule di aderire al piatto. </li><li> Portare le cellule nella piastra di Petri e pozzetti 96 piastra PCR con coperchio su ghiaccio per un microscopio ottico con obiettivo 10X. </li><li> Aumentare l&#39;apertura dell&#39;ago dell&#39;aspiratore picchiettando delicatamente la fine disegnata su the aspiratore ago su una superficie dura in modo tale che la punta si interrompe. Inserire l&#39;estremità larga dell&#39;ago di aspirazione in chiaro fine del microaspirator. </li><li> Porre la capsula di Petri contenente cellule sul palco microscopio. Posizionare il boccaglio rossa dell&#39;aspiratore in bocca. Con una mano per spostare l&#39;ago aspiratore e l&#39;altra mano per spostare la piastra di Petri contenente cellule. Identificare singole cellule da sequenziato. </li><li> Usare la bocca di aspirazione, disegnare una singola cella nel ago aspiratore con ~ 1-2 ml di supporto o PBS. Trasferire la cella in 8 ml di acqua all&#39;interno di un singolo pozzetto della piastra a 96 pozzetti PCR. Evitare l&#39;introduzione di bolle durante il trasferimento alla cella. </li><li> Ripetere il punto 1.2.7 fino a quando è stato isolato il numero desiderato di cellule. Mantenere la piastra PCR su ghiaccio e coperto con coperchio tra cellule raccolta. Segnare i pozzi che hanno ricevuto le cellule. <ol><li> Mentre la raccolta singole cellule, scongelare il 10X singolo lisi cellulare e buffer di frammentazione da tutta gKit di amplificazione enome. Dopo aver raccolto il numero desiderato di celle, procedere immediatamente a tutto amplificazione del genoma. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Whole Genome Amplification <ol><li> Per prevenire la contaminazione durante tutto l&#39;amplificazione del genoma, aggiungere tutti i reagenti all&#39;interno di una cappa di coltura di tessuti, utilizzare puntali per pipette con filtri, e cambiare il puntale tra i pozzi. </li><li> Preparare una soluzione di lisi e la frammentazione tampone di lavoro dal kit intero genoma di amplificazione (WGA). Per ogni set di fino a 32 celle, unire 32 ml di 10x singola lisi cellulare e buffer di frammentazione e 2 ml di proteinasi K soluzione in una provetta. Agitare la provetta per mescolare le soluzioni. </li><li> Aggiungere 1 ml di lisi e soluzione tampone frammentazione di lavoro per ciascun bene e pipettare su e giù per mescolare. </li><li> Coprire la piastra e sigillare tutti i pozzetti con un film plastico. centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> ciclo termico come follOWS: 50 ° C, 1 h e 99 ° C, 4 min. </li><li> Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> Preparare una soluzione tampone di preparazione biblioteca di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 2 ml di 1x tampone preparazione singola libreria di celle e 1 ml di soluzione di stabilizzazione biblioteca in una provetta. Preparare la soluzione di lavoro per diverse celle nella stessa provetta. </li><li> Rimuovere la pellicola di plastica e aggiungere 3 ml di soluzione di tampone di preparazione libreria per ogni pozzetto. Pipettare il contenuto del bene su e giù per mescolare. Sostituire la pellicola di plastica. NOTA: La pellicola di plastica può essere riutilizzata durante l&#39;intero processo genoma di amplificazione fino pozzetti iniziano a fori nella pellicola. Quando si verifica ciò, passare a un nuovo film di plastica. </li><li> Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto ogiva e incubare a 95 ° C per 2 min. </li><li> Raffreddare la piastra su ghiaccio e brevementecentrifugare la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 1 ml enzima preparazione libreria per ogni bene, e pipetta il contenuto del bene su e giù per mescolare. Mantenere l&#39;enzima preparazione biblioteca sul ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica. </li><li> Brevemente centrifugare la piastra in mini filatore piastra e ciclo termico come segue: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C. </li><li> Raffreddare la piastra su ghiaccio e centrifugare brevemente la piastra in un mini piatto filatrice. </li><li> Preparare una miscela di amplificazione di lavoro da tutto il kit di amplificazione del genoma. Per ogni cella, unire 48,5 acqua ml, 7.5 ml 10x amplificazione master mix, e 5 ml WGA DNA polimerasi in una provetta. Preparare la miscela di lavoro per diverse celle nella stessa provetta. Mantenere il mix di lavoro sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere la pellicola di plastica, aggiungere 61 ml di lavoro mix di amplificazionead ogni bene, e il contenuto della pipetta di bene su e giù per mescolare. Tenere il mix di amplificazione a lavorare su ghiaccio o in un blocco freddo in tutta questa fase. Sostituire la pellicola di plastica. </li><li> Brevemente centrifugare la piastra in una mini piatto girevole e il ciclo termico seguente: 95 ° C, 3 min, 25 cicli di 94 ° C, 30 sec e 65 ° C, 5 min, e mantenere a 4 ° C. </li><li> Trasferimento 60 ml di ogni campione in una provetta separata e conservare a - 20 ° C per l&#39;uso al punto 3. </li><li> Aggiungere dye DNA loading al restante volume di ogni campione (3 ml di 6x DNA loading dye a 15 microlitri di campione) e funzionamento 5 microlitri da ogni reazione su un gel di agarosio 1%. NOTA: Le cellule che amplificati con successo apparirà come uno striscio da 250 a 1000 bp. I campioni che non presentano una sbavatura o mostrano solo una macchia debole è improbabile per produrre dati di sequenziamento utili. </li></ol> 3. Sequencing <ol><li> Purificare i campioni con perline paramagnetici. <ol><li> Thacampioni di DNA W sul ghiaccio. perline Vortex paramagnetici fino a quando la soluzione è omogenea e incubare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 min. </li><li> Trasferire 20 ml di ogni campione di DNA in una provetta pulita. Il resto del campione può essere conservato a -20 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml (1.5x) di perline paramagnetici ad ogni campione di DNA e vortex per miscelare. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Lasciare la soluzione stock di perline a temperatura ambiente per l&#39;uso nel passo 3.4. </li><li> Posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per 2 minuti, o fino a quando le perle formano un pellet e il surnatante è chiaro. </li><li> Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile senza disturbare le perline. </li><li> Aggiungere 180 ml di 80% di etanolo alla miscela DNA-tallone. Ruotare i tubi diverse volte rispetto al magnete di &quot;lavaggio&quot; le perle attraverso la soluzione di etanolo. </li><li> Usando una pipetta P200, rimuovere la maggior quantità di lavaggio etanolo come posBLE senza disturbare le perline. </li><li> Ripetere 3.1.6 e 3.1.7. </li><li> Far asciugare le perle per circa 10 minuti o fino a quando non è più l&#39;etanolo è visibile. Procedere alla fase successiva, quando le perline appaiono rotti o cadere dalla parete del tubo. </li><li> Rimuovere i campioni dalla striscia magnetica. Aggiungere 40 ml di 10 mM Tris pH 8,0 per eluire il DNA dalle perline e vortice dei campioni per risospendere le sfere. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> centrifugare brevemente i campioni per raccogliere il liquido sul fondo del tubo e posizionare i tubi su una striscia magnetica tubo per almeno due minuti. Trasferire il eluente in provette da microcentrifuga puliti senza disturbare le perline. </li></ol></li><li> normalizzazione del campione <ol><li> Quantificare la concentrazione di ogni campione utilizzando uno spettrofotometro. Le concentrazioni dovrebbero variare da 10 a 30 ng / mL. </li><li> Diluire ciascun campione a 0,2 ng / ml usando 10 mM Tris pH 8,0. Le seguenti operazioni richiedono un minimo input di 5 ml di questa diluizione. </li></ol></li><li> preparazione Biblioteca <ol><li> Preparare le librerie di sequenziamento seguendo le istruzioni del kit di preparazione libreria 13. </li></ol></li><li> pulizia finale <ol><li> Pulire i campioni in base al passo 3.1. Per lunghezze di lettura di 50 bp, 75 bp, o 150 punti base, utilizzare un rapporto di tallone di assaggiare volume di 1,5x, 1x, o 0.6x, rispettivamente. Eluire con 15 ml di 10 mM Tris pH 8.0. </li><li> Eseguire i campioni su un analizzatore frammento controlla la distribuzione delle dimensioni della libreria 14. La distribuzione dimensionale dovrebbe essere uniformemente diffondersi da 150 al 900 bp. </li></ol></li><li> Quantificare i campioni utilizzando qPCR <ol><li> Utilizzando un kit di quantificazione biblioteca, impostare una reazione qPCR secondo le istruzioni del kit 15. Lascia un vuoto di colonna per aggiungere norme positive (norme DNA del kit) e gli standard negativi (acqua o altra soluzione vuota). </li><li> ciclo termico come Folbassi: 95 ° C, 5 min (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 35 cicli di 95 ° C, 30 sec (velocità di rampa di 4,8 ° C / sec) e 60 ° C, 45 sec (velocità di rampa di 2,5 ° C / sec). </li></ol></li><li> pooling <ol><li> Determinare come sono necessarie molte corsie sulla cella a flusso e dividere i campioni in gruppi, con un gruppo per corsia. </li><li> Per ciascun gruppo di campioni, scegliere il campione con la più bassa concentrazione sulla base dei dati qPCR dal punto 3.5.2 e normalizzare tutti i campioni in quel gruppo a detta concentrazione utilizzando 10 mM Tris pH 8,0. </li><li> Pool i campioni in ciascun gruppo insieme. </li></ol></li><li> sequencing <ol><li> Piscine di carico sulla macchina di sequenziamento di prossima generazione seguenti procedure standard 16. </li></ol></li></ol> Analisi 4. I dati NOTA: Un ambiente basato su Unix è necessario per eseguire i programmi e gli script in questa sezione. Installare il software di cui al protocollo dopo la loro in<html> guide instal-. Tutti gli script possono essere trovati a https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. <ol><li> Tagliare la legge a 40-nt utilizzando fastx_trimmer da FASTX-Toolkit versione 0.0.13 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq </li><li> Allineare la legge al genoma appropriata di riferimento (MM9 per il mouse, hg19 per l&#39;uomo) con BWA versione 0.6.1 con le opzioni di default 18. bwa aln mm9.fa example.trim.fastq&gt; example.sai bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq&gt; example.sam </li><li> Rimuovere allineamenti di CHRM e cromosomi casuali, quindi ordinare e indicizzare il file BAM risultante utilizzando SAMTools versione 0.1.19 19. grep -v -w CHRM example.sam | grep -v casuale&gt; example.filtered.sam samtools vista example.filtered.sam -uSh | samtools sorta - example.filtered samtools indice example.filtered.bam </li><li> Eseguire HMMcopy per rilevare CNV= &quot;Xref&quot;&gt; 20 <ol><li> Utilizzare gcCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento percentuale di GC per il genoma. Utilizzare l&#39;opzione &quot;w 500000&quot; per specificare la dimensione della finestra. Utilizzare la stessa versione del file di riferimento FASTA utilizzato nel passaggio 4.2, ma fare in modo CHRM e cromosomi casuali vengono rimossi dal file FASTA. gcCounter -w 500000 mm9.fa&gt; mm9_gc.wig </li><li> Utilizzare generateMap.pl in HMMcopy per generare un file di manovra per mappability. Utilizzare l&#39;opzione &quot;w 40&quot; per specificare leggere lunghezza. Utilizzare lo stesso file di riferimento fasta utilizzato nel passaggio 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig </li><li> Utilizzare mapCounter in HMMcopy per generare un file di riferimento mappability per il genoma. Utilizzare l&#39;opzione &quot;w 500000&quot; per specificare la dimensione della finestra. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig&gt; mm9_map.wig </li><li> Utilizzare readCounter in HMMcopy per generare un file di manovra per ogni file BAM. readCounter -w 500000 example.filtered.bam&gt; input.wig </li&gt; <li> Modificare i percorsi dei file di riferimento negli script R (run_hmmcopy.mm9.r o run_hmmcopy.hg19.r), usare i file generati sopra a 4.4.1 (ad esempio, mm9_gc.wig) e 4.4.3 (per esempio, mm9_map. parrucca) per le variabili gfile e MFILE, che si riferiscono al file di riferimento percentuale di GC e riferimento mappability, rispettivamente. Quindi eseguire lo script R fornito &quot;run_hmmcopy.mm9.r&quot; o &quot;run_hmmcopy.hg19.r&quot;. R CMD LOTTO run_hmmcopy.mm9.r o R CMD LOTTO run_hmmcopy.hg19.r </li><li> Per l&#39;elaborazione in batch di un insieme di file BAM, inserire i file BAM in una singola cartella ed eseguire lo script fornito &quot;HMMpipe.pl&quot; nel pacchetto di chiamare i segmenti e calcolare i punteggi di variabilità (VS). Seguire il formato: perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9 </li></ol></li><li> Eseguire DNAcopy per rilevare CNV 21. <ol><li> Utilizzare SAMtools versione 0.1.19 per estrarre mappata univocamente legge da ciascun file BAM. Vista samtools -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i &quot;^ @ | XT: A: U&quot; | samtools vista -shu -&gt; example.mapped.bam </li><li> Utilizzare MarkDuplicates in Picard versione 1.94 per contrassegnare i duplicati PCR nel BAM file di 22. java -jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam USCITA = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true </li><li> Utilizzare coveragebed in bedtools versione 2.17.0 per contare mappato legge in ciascuna delle finestre dinamica 500kb mappabili predefiniti nel file da letto disponibile &quot;mm9.500k.dynamic.win.bed&quot; o &quot;hg19.500k.dynamic.win.bed&quot; 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sorta -k1,1 -k2,2n&gt; example.nondup.counts </li><li> Utilizzare lo script Perl fornito &quot;normalizeGC.pl&quot; per normalizzare i conteggi di lettura in base alla condizione file di riferimento contenuto GC &quot;mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt&quot; o &quot;hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt &quot;. perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts&gt; example.bam.norm.counts </li><li> Utilizzare la R script &quot;dnacopy.r&quot; fornito a chiamare i segmenti. R CMD LOTTO dnacopy.r </li></ol></li><li> identificare CNV <ol><li> Escludere le cellule per i quali il VS calcolato 4.4.6 supera 0,26. </li><li> Filtrare i segmenti chiamati da HMMcopy in 4.4.6 per includere solo quelli per i quali il rapporto mediana log 2 è maggiore di 0,4 (guadagno putativo) o meno di -0.35 (perdita putativo). </li><li> Filtrare i segmenti chiamati da DNAcopy in 4.5.5 per includere solo quelli per i quali il segmento media è maggiore di 1,32 o inferiore a 0,6. </li><li> Sovrapporre i segmenti da 4.6.2 e 4.6.3, chiamando CNV solo nelle regioni in cui sia HMMcopy e DNAcopy identificano un guadagno o una perdita putativo putativo. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li><li>Torres, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317 (5840), 916-924 (2007).</li><li>Itsara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Analysis+of+Large+Copy+Number+Variants+and+Hotspots+of+Human+Genetic+Disease.">Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease.</a> Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).</li><li>Sudmant, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity,+population+stratification,+and+selection+of+human+copy-number+variation.">Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation.</a> Science. 349 (6253), aab3761 (2015).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumor+progression+from+genomic+heterogeneity.">Inferring tumor progression from genomic heterogeneity.</a> Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).</li><li>Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+genomic+heterogeneity+in+breast+cancer+with+clonal+divergence+between+primary+carcinomas+and+lymph+node+metastases.">Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases.</a> Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).</li><li>Yates, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Forsberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+somatic+structural+changes+in+the+nuclear+genome+of+human+blood+cells.">Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells.</a> Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).</li><li>Laurie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+from+birth+to+old+age+and+its+relationship+to+cancer.">Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).</li><li>Jacobs, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+and+its+relationship+to+aging+and+cancer.">Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+low+levels+of+aneuploidy+across+mammalian+tissues.">Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+megabase-scale+somatic+copy+number+variation+using+single-cell+sequencing.">Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing.</a> Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).</li><li>. KAPA Library Quantification Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2016)</li><li>. DNAcopy Available from: <a target="_blank" href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html</a> (2016)</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism.">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell.">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+breast+cancer+revealed+by+single+nucleus+genome+sequencing.">Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.</a> Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).</li><li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei.">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li><li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Genomics:+Advances+and+Future+Perspectives.">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tradizionalmente, individuando CNVs e aneuploidie a livello delle singole cellule necessarie metodi citologici come il pesce e SKY. Ora, singola sequenza cella è emerso come un approccio alternativo per tali domande. sequenziamento singola cella ha dei vantaggi rispetto FISH e il cielo come è sia genome-wide e alta risoluzione. Inoltre, quando si applicano metodi di controllo della qualità appropriati, il sequenziamento singola cellula in grado di fornire una valutazione più affidabile di CNVs e aneuploidia in quanto non è suscettibile di ibridazione e la diffusione manufatti inerenti alla FISH e SKY. Tuttavia, molte delle recenti applicazioni di sequenziamento singola cellula non sono state dimostrate dalla valutazione approfondita della sensibilità e specificità dei metodi e delle analisi. In effetti, alcuni degli approcci analitici utilizzati da altri studi sono associati con alte frequenze (&gt; 50%) di falsi positivi CNV chiama 12. L&#39;approccio che descriviamo è stato rigorosamente testato utilizzando cellule di knproprio fardello CNV, al fine di determinare i tassi di scoperta veri e falsi e ottimizzare la sensibilità e la specificità del CNV rilevazione 12. Utilizzando il controllo di qualità e approcci analitici descritti in questo protocollo, circa il 20% dei guadagni di 5 Mb, il 75% delle perdite 5 Mb, e tutto CNV superiore a 10 Mb può essere rilevato. Sebbene determinazione del false discovery rate di singola sequenza cella è difficile, abbiamo stimato per essere inferiore al 25%. Questo protocollo può essere applicata alle cellule da una varietà di fonti, gli script possono essere modificati per regolare la risoluzione della rilevazione CNV, e il protocollo può essere adattato per identificare altri tipi di alterazioni genomiche. Ci sono una varietà di mezzi di dissociare tessuti freschi in singole cellule, e molte pubblicazioni descrivono le procedure ottimizzati per specifici tessuti, come la pelle e il cervello 24 25. Preferiamo isolare singole cellule da microaspirazione quanto permette fo<html> r valutazione visiva di ogni cella da sequenziare. Tuttavia, è anche possibile isolare singole cellule mediante fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 26 e dispositivi microfluidici 27. Se l&#39;isolamento singola cella e tutta amplificazione del genoma viene eseguita manualmente, è ragionevole isolare e amplificare fino a quaranta celle in una sola seduta. Al fine di ottenere i dati di sequenziamento singola cellula di alta qualità, è fondamentale che l&#39;amplificazione dei genomi singola cellula è uniforme e completo. Troviamo che la qualità di singole cellule isolate, nonché l&#39;efficienza della lisi ed amplificazione ha un impatto significativo sulla qualità dei dati di sequenziamento. Come tale, le cellule dovrebbero essere raccolti dal loro ambiente nativo appena prima di isolamento e di tutta l&#39;amplificazione del genoma dovrebbe iniziare subito dopo che le cellule sono isolate. Inoltre, la fase di lisi e frammentazione dovrebbe essere seguita esattamente come descritto nella procedura 2,3-2,6. &quot;&gt; Gli algoritmi possono essere regolati per cambiare la risoluzione di rilevazione CNV, con opposti effetti sulla sensibilità e specificità 12. E &#39;inoltre possibile regolare le soglie per rilevare intero cromosoma aneuploidia nella cornice di tetraploidy 11. Tuttavia, troviamo che il nostro approccio è limitato a rilevare CNV maggiore di 5 Mb, come rumore introdotto durante tutta la amplificazione del genoma complica l&#39;individuazione di varianti minori 12. miglioramenti futuri in tutto il genoma di amplificazione approcci dovrebbero in ultima analisi, migliorare la risoluzione di rilevamento CNV utilizzando un&#39;unica sequenza cella. Sequenziamento singola cella consente per le indagini non solo le alterazioni del numero di copie, ma anche le variazioni singolo nucleotide 28, 29 e 30 variazione strutturale. Il nostro protocollo per l&#39;isolamento delle cellule singolo può essere applicato a rispondere a queste altre quesug-. Tuttavia, la scelta di tutto il metodo genoma di amplificazione dipende dall&#39;applicazione specifica. Il metodo descritto in questo protocollo, che si basa sulla reazione a catena della polimerasi, è più adatto per la rilevazione di alterazioni del numero di copie perché è associato con livelli più bassi di amplificazione pregiudizi 32. Per indagare altri tipi di alterazioni genomiche, come singoli polimorfismi nucleotidici, altri metodi di amplificazione del genoma intero sono ritenuti essere più adatto 31, 32.

Alterazioni nel numero di copie di DNA possono variare nel formato da diverse paia di basi (numero di copie varianti) (CNV) a interi cromosomi (aneuploidie). Alterazioni del numero di copie che interessano ampie regioni del genoma possono avere notevoli conseguenze fenotipiche alterando l&#39;espressione fino a migliaia di geni 1, 2. CNV che sono presenti in tutte le cellule di una popolazione può essere rilevato mediante sequenziamento rinfusa o metodi microarray basati 3, 4. Tuttavia, le popolazioni possono anche essere geneticamente eterogenea, con CNVs esistenti in un sottogruppo della popolazione o anche singole cellule. Eterogeneità genetica è comune nel cancro, guidando l&#39;evoluzione del tumore, e presenti anche in tessuti normali, con conseguenze sconosciute 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Tradizionalmente, l&#39;eterogeneità genetica è stata valutata sia da approcci citologici o sequenziamento di massa. Approcci citologici, come ibridazione in situ fluorescente (FISH), gli spread cromosomiche, e cariotipo spettrale (SKY), hanno il vantaggio di alterazioni che identificano presenti nelle singole cellule, ma hanno alti tassi di errore a causa di artefatti di ibridazione e la diffusione 11. Questi approcci sono anche limitati nella loro numero di copie risoluzione di sola rivelando cambia a abbracciano diversi megabasi. Sequencing o microarray di DNA di massa, anche se più elevato in precisione e risoluzione, è meno sensibile. Per rilevare eterogeneità genetica da approcci basati sulla popolazione, le varianti devono essere presenti in una frazione sostanziale di cellule nella popolazione. La comparsa di metodi per amplificare il DNA genomico da singole cellule ha reso possibile sequenziare il genoma di singole cellule. seque cella singolancing presenta i vantaggi di alta risoluzione, alta sensibilità, e, quando si applicano i metodi di controllo della qualità adeguati, elevata precisione 12. Qui, si descrive un metodo per la rilevazione megabase scala alterazioni del numero di copie in singole cellule. Noi isolare le cellule singole da microaspirazione, amplificare il DNA genomico usando linker-adattatore PCR, preparare librerie per il sequenziamento di nuova generazione, e rilevare il numero di copie varianti sia da modello nascosto di Markov e segmentazione binario circolare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing (ID 3/16&#34;, OD 5/16&#34;, ~1 foot)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing (ID 5/16&#34;, OD 7/16&#34;, ~6 inches)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 um)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28144-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette (5 ml)</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-2837-5</td>
			<td>Any plastic 5 mL pipette should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Water Trap for Oxygen Use</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>700220210813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>34502-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470156-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell&#160;Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR&#160;Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td>Any 96-well PCR plate should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-081</td>
			<td>Any 96-well tissue culture plate should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WGA4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; Film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSA5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini plate spinner</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1225Z37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096&#160;</td>
			<td>Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt Ampure Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Any similar magnetic tube strip should suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4845&#160;</td>
			<td>This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of copy number alterations using single cell sequencing

Riconoscimento di modifiche genomiche a risoluzione singola cella è importante per la caratterizzazione eterogeneità genetica ed evoluzione nei tessuti normali, i tumori, e le popolazioni microbiche. I metodi tradizionali per valutare l&#39;eterogeneità genetica sono stati limitati dalla bassa risoluzione, bassa sensibilità, e / o bassa specificità. sequenziamento cella singola è emerso come un potente strumento per la rilevazione di eterogeneità genetica ad alta risoluzione, alta sensibilità e, opportunamente analizzata, alta specificità. Qui forniamo un protocollo per l&#39;isolamento, tutta l&#39;amplificazione del genoma, sequenziamento e l&#39;analisi di singole cellule. Il nostro approccio consente l&#39;identificazione affidabile di megabase scala varianti numero di copie in singole cellule. Tuttavia, gli aspetti di questo protocollo può essere applicato anche per studiare altri tipi di alterazioni genetiche in cellule singole.

L&#39;aspiratore montato dovrebbe essere simile a quello della Figura 1A. L&#39;ago deve essere disegnato in modo che sia sufficientemente ampia per accogliere una singola cella, ma non così ampia che un grande volume è redatta con singola cella. Aspirando singole cellule è più facile quando ci sono da uno a cinque celle in un campo 10 volte (Figura 1B). Se intera amplificazione del genoma è riuscita, il campione apparirà come una macchia su un gel di agarosio (figura 2, corsie 1, 2, 4, 5, 6 e 7). Uno striscio debole o assente indica una reazione di amplificazione fallito e il campione non deve essere sequenziato (Figura 2, corsie 3 e 8). Dopo la preparazione biblioteca, la distribuzione delle dimensioni frammento di campioni deve essere valutata mediante elettroforesi capillare su un analizzatore frammento.Successo librerie preparati avranno piuttosto distribuzione uniforme di dimensioni frammento di 150 bp al 900 (Figura 3, A, B). Preparazione biblioteca riuscita si tradurrà in una distribuzione di dimensione del frammento distorta e tali librerie non dovrebbe essere sequenziato (Figura 3C). L&#39;elaborazione di dati di sequenziamento attraverso il modello di Markov nascosto (HMMcopy) e la segmentazione binario circolare (DNAcopy) analizzerà il genoma di ogni cella in segmenti di numero di copie stimato. Questi segmenti possono essere filtrati per identificare quelli con un numero di copie stimato coerente con guadagno o perdita in una singola cella (Tabella 1). Questi segmenti filtrati da HMMcopy e DNAcopy dovrebbero quindi essere sovrapposte per individuare alta fiducia CNV. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> Figura 1. isolamento delle cellule singolo. (<html> A) assemblata microaspirator. (B) Un campo 10 volte mostra dissociato cellule (frecce) e l&#39;ago microaspirator (in basso a destra). Aspirando singole cellule è più facile quando ci sono da uno a cinque celle in un campo 10X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> Figura 2. amplificazione del genoma intero. Agarosio elettroforesi su gel di 5 ml di prodotti dell&#39;intero genoma di amplificazione. I campioni che amplificano con successo apparirà strisci come brillanti da 100 bp a 1 kb (corsie 1, 2, 4, 5, 6 e 7) e può essere sequenziato. I campioni che non amplificano con successo produrrà sbavature deboli o nessuna sbavatura (corsie 3 e 8) e non dovrebbe essere sequenziato.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Figura 3. Preparazione biblioteca. I risultati rappresentativi da un analizzatore di frammento. I grafici mostrano dimensione del frammento (in bp) sull&#39;asse X e unità di fluorescenza relativa (RFU) sull&#39;asse Y. A destra di ogni grafico è una corsia di gel simulato. (A) i risultati di un campione ideale, con una distribuzione uniforme tra 150 e 900 bp e senza picchi taglienti o pregiudizi verso un lato. Questo campione è accettabile per il sequenziamento. (B) I risultati di un campione bene, con una distribuzione delle dimensioni oblique verso dimensioni frammento più bassi. Mentre questo non è ottimale, il campione può essere ancora sequenziato. (C) i risultati da un campione fallito, con prevalenza di piccole dimensioni frammento. Questo è probabilmente causato da una prolungata incubazione durante la fase di tagmentationdi preparazione library. Questo campione non deve essere sequenziato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Campione </td><td> Segmento </td><td> Chr </td><td> Inizio </td><td> Fine </td><td> Stato </td><td> Mediano </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> chr8 </td><td> 144.500.001 </td><td> 146.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67.000.001 </td><td> 134.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> chr19 </td><td> 1 </td><td> 20.000.000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> Chry </td><td> 1 </td><td> 59.500.000 </td><td> 2 </td><td> -1,506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Campione </td><td> Chrom </td><td> Inizio bin </td><td> fine bin </td><td> Inizio </td><td> Fine </td><td> Seg media </td><td> med Seg </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62.612.945 </td><td> 129.971.511 </td><td> 1,4688 </td><td> 0.157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28.416.392 </td><td> 1,4141 </td><td> 0,1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51.659.160 </td><td> 95.343.369 </td><td> 1,3548 </td><td> 0,1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> Chry </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23.805.358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0,3591 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. L&#39;analisi dei dati. segmenti filtrati generati da HMMcopy e DNAcopy da una singola cellula. La sovrapposizione di questi due risultati rivela un guadagno sul cromosoma 10 da 67 a 130 Mb, nonché un guadagno sul cromosoma 19 da 0 a 20 Mb. Abbiamo trovato che i guadagni sulla porzione prossimale del cromosoma 19 sono un artefatto di sequenziamento singola cella 12.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing at JoVE.com

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

sequenziamento cella singola è uno strumento sempre più popolare e accessibile per affrontare le modifiche genomiche ad alta risoluzione. Forniamo un protocollo che utilizza un&#39;unica sequenza cella per identificare il numero di copia alterazioni in singole cellule.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Ricerca

Genetica

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...