Name: simultaneous measurement of mitochondrial calcium and mitochondrial membrane potential in live cells by fluorescent microscopy
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy at JoVE.com

우리는 금융 지원을 위해 박사 Kirstin Elgass 및 기술 지원 모나 마이크로 이미징 박사 사라 크리드, 그리고 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)과 의료 연구위원회 UK 감사합니다. MMcK는 호주 연구위원회 미래 원정대 제도 (FT120100459), 윌리엄 버클 랜드 재단, 호주 미토콘드리아 질환 재단 (AMDF), 의료 연구 및 모나 쉬 대학의 허드슨 연구소 지원됩니다. 이 작품은 빅토리아 정부 운영 인프라 지원 제도에 의해 지원되었다.

세포의 1. 준비 <ol><li> 10cm 세포 배양 접시에 세포 또는 75cm 성장 5 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S가 보충 배지 [10 ㎖ 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM)에서 두 플라스크 ) 37 ° C / 5 % CO 2에서. </li><li> 세포를 수확하려면 다음 5 ml의 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)로 세척, 흡인에 의해 용지를 제거합니다. 다음 (w / v)의 트립신 / 0.25 %를 1.5 ml의 0.2...

<ol>
	<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+hub+of+cellular+Ca2++signaling.">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li><li>Jacobson, J., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+mitochondria+and+cellular+calcium+signalling.">Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling.</a> Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).</li><li>Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+as+a+mediator+of+cell+energy+demand+and+a+trigger+to+cell.">Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).</li><li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease.">Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).</li><li>Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++homeostasis+during+Ca2++influx+and+Ca2++release+in+gastric+myocytes+from+Bufo+marinus.">Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus.</a> J. Physiol. 522, 375-390 (2000).</li><li>Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+of+cytosolic+calcium+oscillations+in+the+mitochondria.">Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria.</a> Cell. 82, 415-424 (1995).</li><li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy.">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).</li><li>Pozzan, T., Rudolf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+mitochondrial+calcium+in+vivo.">Measurements of mitochondrial calcium in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).</li><li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2++revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin.">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li><li>Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+respond+to+Ca2++already+in+the+submicromolar+range:+correlation+with+redox+state.">Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state.</a> Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).</li><li>Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHELATOR:+an+improved+method+for+computing+metal+ion+concentrations+in+physiological+solutions.">CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions.</a> BioTechniques. 12, 870-879 (1992).</li><li>McKenzie, M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Cellular+Bioenergetics+Causes+Mitochondrial+Calcium+Handling+Defects+in+MT-ND5+Mutant+Cybrids.">Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids.</a> PLoS One. 11, e0154371 (2016).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cellular+indicators+are+extruded+by+the+multidrug+resistance+protein.">Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.</a> J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).</li><li>Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. . 2. n. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cyclophilin+D+and+the+mitochondrial+permeability+transition+enhances+beta-cell+survival+and+prevents+diabetes+in+Pdx1+deficiency.">Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).</li><li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration.">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li></ol>

칼슘은 근육 수축, 신경 신호 전달 및 세포 증식 (13)를 포함한 많은 세포 공정에서 중요한 역할을한다. 세포의 칼슘 농도의 증가는 종종 직접 ATP 생성 3을 높이기 위해 미토콘드리아의 산화 적 인산화를 자극 할 수 칼슘, 에너지 수요와 연결되어 있습니다. 우리가 효과적으로 미토콘드리아 칼슘 축적을 모니터링하고,이 기능은 유전 적 요인 및 약리학 적 제제 모...

미토콘드리아는 지역 칼슘 버퍼 1로 작용하여 세포 내 칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을한다. 칼슘은 2 +, 칼슘 2 + uniporter 통해 미토콘드리아 내막 (ΔΨ 분) 2에서 존재하는 전기 화학적 구배에 의해 구동되는 과정을 미토콘드리아로 들어갑니다. 일단 미토콘드리아 매트릭스 내부, 칼슘은 구연산 사이클 (3)의 세 가지 속도 제한 탈수소 효소를 자극하여 산화 적 인산화를 활성화 할 수 있습니다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다. 미토콘드리아 내의 칼슘 이온 농도가 매우 높아지면, 미토콘드리아 투과성 천이 ΔΨ의 m의 손실의 결과로, 초기화 될 수 있으며, cessatio산화 적 인산화 n 및 4 경로 신호 세포사의 유도. 미토콘드리아는 세포 칼슘의 공간 버퍼링에서 재생 중요한 역할은 미토콘드리아 칼슘의 정확한 모니터링이 중요합니다. 다양한 방법 로다 계 염료의 사용을 포함 미토콘드리아 칼슘을 모니터하기 위해 설립되었다. 그러한 염료, 루비로드-2, AM은 6 미토콘드리아 칼슘 레벨 5를 측정하는 미토콘드리아에 파티션에 매우 효과적이다. 몇몇 염료는 리포좀과 같은 다른 소기관에 축적 또는 세포 세포질에 남아 그러나, 치료가 사용되어야한다. 그럼에도 불구하고, 하류 분석 미토콘드리아 7 것과 이러한 신호들을 구별하기 위해 사용될 수있다. 미토콘드리아 칼슘을 모니터링하는 다른 기술은 형광 리포터 (8)를 구성 이용한다 </s<html> &gt;입니다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 이점은 특히, 예를 들어 인간 COX 소단위 VIII의 N- 말단 타겟팅 신호 내인성 N 말단 펩티드를 이용하여 미토콘드리아를 타겟팅 할 수 있다는 것이다. 이 시스템은 9 신호 미토콘드리아 칼슘 조사 매우 유용 입증되었다 미토콘드리아 타겟팅 쿼린 프로브를 생성하는데 사용되어왔다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 주요 단점은 일시적인 발현에 의해 세포 내로 도입 될 필요가 (특정 세포 유형에 대해 가능하지 가변 결과를 얻을 수 있음) 또는 안정한 발현 시스템 (이는 시간이 소비된다) 만들어 있다는 것이다. 위에 설명 된 문제를 회피하기 위해, 우리는 동시에 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ m을 측정하는 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜은 투과성이 세포에 외인성 칼슘을 추가하는 전술 한 방법에 기초S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 10. 우리의 프로토콜은 다른 방법을 통해 세 가지 주요 이점이있다 : 첫째로, 우리는 FLUO-4, AM 및 TMRM는 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ 분, 매우 독특한 스펙트럼 특성을 갖는 두 개의 염료를 모니터링하는 데 사용할; 둘째, 세포는 FLUO-4 신호는 미토콘드리아 칼슘 감지하는 2 +와 칼슘이 다른 세포 소기관이나 세포의 세포질에 지역화되지 않도록 투과성이있다; 셋째, FLUO-4의 사용 2+ 미토콘드리아 칼슘 감지 유 전적으로 인코딩 된 프로브를 사용하는 경우 존재하는 세포 또는 형질 전환 문제를 부정 빠르고 간단한 세포 염색을 허용한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10566016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin/streptomycin (p/s)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin / 0.25% EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverslip</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80826</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746452</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8126&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+ free Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175-095</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F14201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thapsigargin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9033</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P3000MP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemacytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0925</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>COR430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>COR430641</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurement of mitochondrial calcium and mitochondrial membrane potential in live cells by fluorescent microscopy

외에도 ATP를 생성하는 자신의 중요한 역할에서, 미토콘드리아는 (칼슘) 단단히 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 버퍼 지역 칼슘 역할을합니다. 이렇게하려면 미토콘드리아는 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (ΔΨ 분)에 걸쳐 전기 잠재력을 활용합니다. 미토콘드리아에 칼슘 이온의 유입은 산화 적 인산화 (OXPHOS) 착체를 통해 전자 전달을 증가 시트르산 사이클의 세 속도 제한게나 제를 자극한다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다. 우리는 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ의 m 여기하는 방법을 설명합니다. 세포를 permeabilizing, 미토콘드리아 칼슘에 의해 2+ 수형광 염료를 사용하여 테트라 메틸 ΔΨ m의 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 측정을, 형광 칼슘 지표 FLUO-4 AM을 사용하여 측정 될 수있다. 이 시스템의 이점은 형광 염료 사이의 아주 작은 스펙트럼 오버랩 동시에 정확한 미토콘드리아의 Ca 2+ 및 측정 ΔΨ의 m을 수 있다는 것이다. 칼슘 분취의 순차 첨가를 사용하여 미토콘드리아 칼슘 흡수를 모니터 할 수 있으며, 칼슘 미토콘드리아 막 투과성 전이 및 ΔΨ의 손실을 유도하는 농도 결정 해요.

우리는 칼슘 (12)의 증가를 버퍼링 143B 세포 미토콘드리아의 능력에 MT-ND5 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 여기에 도시 된 예에서, 제어부 (143B) 세포 TMRM FLUO-4와 함께로드하고, 디기 토닌와 permeabilization 전에 AM. 촬상 5 분 후, 1 여덟 순차 추가 : CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 최종 자유 칼슘 이온 농도로 만?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy at JoVE.com

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

The overall goal of this procedure is to provide a simple method for simultaneously measuring mitochondrial calcium uptake and mitochondrial membrane potential in live cells using confocal microscopy. This method can help to answer key questions in the mitochondrial field, such as how mitochondria act as local calcium stores to tightly regulate intracellular calcium concentration. The main advantage of this technique is that both mitochondrial calcium and mitochondrial membrane potential can be specifically measured simultaneously in life cells without the need for genetic manipulation.Though this method can provide insight into calcium regulation in mitochondrial disease pathology, it can also be used to study other newer degenerative conditions, when urinal calcium regulation in crucial. In this procedure, grow the cells on ten centimeter cell culture dishes, or 75 square centimeter flasks, in culture media at 37 degrees Celsius for 24 hours. To harvest the cells, remove media by aspiration, and wash the cells with five milliliters of PBS.Afterward, remove PBS by aspiration. Then add 1.5 milliliters of Trypsin EDTA, and incubate the cells at 37 degrees Celsius for 2 minutes. Next tap the dish gently to remove the cells.Resuspend them in five milliliters of culture media. Afterward, count the cells with a hemocytometer. The day before confocal imaging, plate the cells at 60 to 70 percent confluency in dishes or chambered cover slips.Then incubate the cells overnight at 37 degrees Celsius to allow the cells to attach and recover. In this procedure, prepare the record staining solution with TMRM, Fluo 4 AM, and surfactant. Remove the culture media and wash the cells with 100 microliters of PBS.Next remove PBS and incubate the cells in 100 microliters of record staining solution for 45 minutes at room temperature. Following that, remove the record staining solution and wash the cells in 100 microliters of calcium-free HBSS to remove excess Fluo 4 AM and TMRM. Then prepare the intracellular imagining solution with digitonin, TMRM, and thapsigargin.Next remove the calcium-free HPSS and add 300 microliters of IM imaging solution to the cells. Leave the cells to equilibrate at room temperature for ten minutes before imaging with the calcium chloride additions. Use a low laser power of approximately 5 percent to minimize any photo damage to the cells.Use the setting on the microscope lasers for the excitation and emission spectra of TMRM and Fluo 4 AM.Use a low laser power of approximately five percent with high gain to minimize photo damage of the cells. Next set the microscope to scan images every twenty five seconds. Scan the cells for ten minutes to establish the base line readings for TMRM and Fluo 4 signals.Then pause the image scanning and add 3 microliters of 40 millimolar calcium chloride stock solution directly to the cells in 300 microliters of IM imaging solution. Mix gently with a pipette. When adding calcium solution to the cells, be careful not to move the dish on the microscope stage.Continue image scanning for approximately four minutes. Then repeat calcium chloride additions every four minutes until the desired TMRM or Fluo 4 signals are reached, usually around eight to ten additions. Subsequently add a 1 to 100 dilution of one millimolar FCCP directly to the cells to dissipate the inner membrane potential.Then image the cells for a further five minutes before the experiment is finished. Once the imaging is complete, determine the intensity of the Fluo 4 and TMRM signals using the image analysis software. To do so, open the image, click on the selection tool and select a region of interest that contains mitochondria.Multiple regions of interest can be selected for measurement by opening Analyze, Tools, ROI Manager. Click Add to include the selected ROI for intensity measurement. Repeat previous steps until all ROIs have been added to the ROI manager.Measure the average fluorescent intensity of the TMRM and Fluo 4 signals for each region of interest by selecting the more multi measure function. Make sure that the Measure All Slices is selected, and that One Row Per Slice is deselected. Then click Okay to obtain a table of mean fluorescent intensity of the TMRM and Fluo 4 signals for each ROI at each time point.Then combine the data to calculate the average intensity and standard deviation for the TMRM and Fluo 4 signals. In this experiment, 143B cells were preloaded with Fluo 4 AM and TMRM before permeabilization with digitonin. Following each calcium chloride addition, the TMRM signal decreases as the influx of calcium ions into the mitochondria dissipates the mitochondrial membrane potential.A small membrane potential is evident following permeability transition as the addition of 10 micromolar FCCP still induces a collapse of membrane potential. Here the mitochondrial calcium concentration, indicated by Fluo 4 signal, begins to increase following the second calcium chloride addition when the free calcium in the media reaches 0.32 micromolar. Each subsequent calcium chloride addition caused a progressive increase in mitochondrial calcium.Shown here are the images of simultaneous measurements of membrane potential in mitochondrial calcium. The red signal indicates TMRM and the green signal indicates Fluo 4. Once mastered, this technique can be done in approximately two hours if performed properly.After watching this video, you should have a good understanding of how to measure mitochondrial calcium levels and mitochondrial membrane potential simultaneously on confocal microscopy using the addition of exogenous calcium to the permeabilized cells. Don't forget that working with FCCP and digitonin can be extremely hazardous, and precautions such as wearing PPE should always been taking when performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

연구

생물학

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준의 정량화

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

저자 스포트라이트: HeLa 세포에서 실시간 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 과산화물 수준의 형광 기반 정량화  

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...