Name: live cell imaging and 3d analysis of angiotensin receptor type 1a trafficking in transfected human embryonic kidney cells using confocal microscopy
Uploaded: 2017-03-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy at JoVE.co

وأيد العمل البحوث التي قدمت في هذه المخطوطة من قبل منحة R01 HL121456-01A1 إلى كاثرين ساندبرج. وأيد هذا العمل بالإضافة إلى توافر لايكا SP8 AOBS في الميكروسكوب والموارد المشتركة تصوير (مصر) في المركز الطبي بجامعة جورج تاون الذي يتم تمويله جزئيا من قبل P30-CA051008 من المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية. نحن نعترف بامتنان لايكا المساعدة SP8 التصوير بيتر جونسون، واستخدام زايس LSM880 في مختبر توماس Coate، قسم علم الأحياء في جامعة جورج تاون بمساعدة التصوير التي تقدمها ألما أرنولد من كارل زايس المجهر LLC. هذا المحتوى من المخطوط هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

اليوم الأول البذر 1. خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاملة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM). إضافة 50 مل من مصل بقري جنيني، 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين، 5 مل من L-الجلوتامين إلى 450 مل من DMEM لجعل 500 مل من DMEM ك?...

<ol>
	<li>Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+angiotensin+II+type+1A+receptor+intracellular+retention,+degradation,+and+recycling+by+Rab5,+Rab7,+and+Rab11+GTPases.">Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases.</a> J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).</li><li>Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+angiotensin+II+and+its+AT1+and+AT2+receptors:+evidence+for+selective+sorting+of+receptor+and+ligand.">Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand.</a> Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).</li><li>Hunyady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+PI+3-kinase+dependence+of+early+and+late+phases+of+recycling+of+the+internalized+AT1+angiotensin+receptor.">Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).</li><li>Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+angiotensin+II+in+rat+myometrial+cells.">Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells.</a> Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).</li><li>Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab11+coordinately+regulate+the+recycling+of+angiotensin+II+type+I+receptor+as+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton-dependent+Rab+GTPase-regulated+angiotensin+type+I+receptor+lysosomal+degradation+studied+by+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+prevents+maturation+of+autophagic+vacuoles+by+inhibiting+fusion+between+autophagosomes+and+lysosomes+in+rat+hepatoma+cell+line,+H-4-II-E+cells.">Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells.</a> Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).</li><li>Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+angiotensin+II+activates+rat+myometrium.">Intracellular angiotensin II activates rat myometrium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).</li><li>Fortian, A., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+reveals+high+stoichiometry+of+Grb2+binding+to+the+EGF+receptor+sustained+during+endocytosis.">Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).</li><li>Aymerich, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+G-protein-coupled+receptor+imaging+to+understand+and+quantify+receptor+dynamics.">Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics.</a> ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).</li><li>Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Detection+of+Diversity+and+Bias+in+GPCR+Function.">Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).</li><li>Inuzuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+ligand-induced+activation+of+angiotensin+II+type+1+receptor+signaling+by+the+type+2+receptor+via+protein+kinase.">Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase.</a> C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+angiotensin+receptor+signaling+through+Erk1/2+pathway+by+a+novel+peptide.">Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Mueller, S. C., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+asialoglycoproteins+by+rat+hepatocytes:+receptor-positive+and+receptor-negative+endosomes.">Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes.</a> J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+Lysotracker+Red+to+a+green+fluorescent+molecule.">Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule.</a> Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).</li><li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1,+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H(+)-ATPase,+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells.">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li></ol>

<html> التجارب الأولية المقدمة هنا توضح أن أكثر من دورة زمنية قصيرة بدلا من 24 دقيقة، لم يطرأ أي تغيير ملموس في تسليم AT 1A R-GFP إلى الجسيمات الحالة. بشكل عام، يمكن أن يحدث تسليم مستقبلات المنضوية في الجسيمات الحالة في وقت مبكر من 15-20 دقيقة. هذه التجربة هي متسقة مع فرضية ?...

ويتمثل الهدف العام للحصول على أدلة الكمي في الزمان والمكان من colocalization مستقبلات مع العضيات التحت خلوية محددة بعد العلاج مع ناهض مستقبلات. وهكذا، فإن الهدف المباشر هنا هو لالتقاط الوقت الفاصل بين الصور مبائر من الجسيمات الحالة والغشاء الذي يمتد مستقبلات في خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة) بعد ترنسفكأيشن وبعد ذلك تجميع وتحليل البيانات التصوير في 3D لقياس كمي لتسليم مستقبلات ل الجسيمات المحللة. التحقيق في الاتجار وقت واحد من مستقبلات الغشاء مع الجسيمات الحالة أو العضيات الأخرى خلال الإلتقام عندما تفعيلها من خلال يجند مستقبلات يمكن أن تساعد في تحديد كيفية تنظيم مستقبلات الغشاء في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. AT 1A يفترض R أن تتحلل في الجسيمات الحالة بعد العلاج مع انج الثاني في أنظمة خلايا نموذج، في المقام الأول HEK293 1 على الرغم من أن غالبية تفصيليتم ترجمة eptors في المقام الأول في الإندوسومات إعادة التدوير عديد الحويصلات لإعادة التدوير في وقت لاحق إلى غشاء البلازما في حين أن الجزء الأكبر من يجند، آنغ الثاني، هو المتدهورة في يحلول 2، 3، 4، 5. وفي الآونة الأخيرة، لي وآخرون. أظهرت باستخدام نقل فورستر للطاقة الرنين (الحنق) وتقنيات مضان المجهر العمر التصوير (FLIM) أن colocalizes AT 1A R (على ~ 10 نانومتر نطاق) مع LAMP1، وهو بروتين غشاء الليزوزومية مما يشير إلى أن ما لا يقل عن بعض من مستقبلات المستهدفة إلى والمتدهورة من الجسيمات الحالة 6. ولاحظ هؤلاء الكتاب أن الكلوروكين الليزوزومية المانع سدت في 1A جمعية R-LAMP1 وهو ما يتسق مع التقارير السابقة تشير إلى أن تأثير الكلوروكين هو لمنع انصهار أواخر الإندوسومات أو autophagosomes مع الجسيمات الحالة. النهج غير المباشرة الأخرى لتحديد AT 1A R لوقد استخدمت ocalization في الجسيمات الحالة bafilomycin، مثبط الليزوزومية أن نستنتج AT جود R 1A في الجسيمات الحالة 3، 4، 5، 6، 7، 8. التصوير الخلية الحية يتجنب الآثار المحتملة للتثبيت على حجم الخلية، وفقدان / يعتم / إعادة توزيع مستقبلات GFP خيالية. وقد اعتمدت الدراسات السابقة على خلايا ثابتة لتحديد colocalization أو توارد من مستقبلات مع الجسيمات الحالة أو باستخدام الخلايا الحية المسمى مع بدائل ملزمة مستقبلات مثل β arrestin 1، 2، 3، 4، 5، 6. التصوير الخلية الحية من GPCRs أخرى باستخدام متحد البؤر القرص الغزل أو ليزر نقطة المسح أسيوطالمجاهر OCAL مجهزة GaASP أو HYD كشف عن مكنت المحققين لمراقبة داخليا والاتجار بها المستقبلات في الخلايا الفردية تصويرها في زي مداخن في 30 ثانية فترات 9 و 10. ولكن حتى عندما يتم جمع الحية خلية ض مداخن بسرعة، قد تحدث التحليل إلا بعد اختيار طائرة واحدة في كل كومة، أي في 2D 10. في حين أن هذا قد يكون كافيا لدراسة المنضوية النوع من الاختزال أو التيروزين كيناز مستقبلات في مسألة ما، و1A روبية AT تتراكم في الحويصلات التي تغير حجم وموضع على مر الزمن، وبالتالي فهي بطبيعتها أكثر صعوبة لعينة كاف باستخدام شريحة واحدة تمثيلية في كل نقطة زمنية. لتحديد دقيق لمسار المسمى AT 1A R من خلال الخلية وللكشف عن كل من السكان من الحويصلات اختلاف في حجم وموضع، فقد تم تطوير هذا الأسلوب للتصوير 3D وتحليل 3D لتتبع هذه التغييرات وأن يكون<html> تستخدم جنبا إلى جنب مع وضع العلامات من مختلف حجرات داخل الخلايا مثل الجسيمات الحالة. يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول للتصوير الخلايا الحية لتصور مباشرة حركة AT 1A R في الخلية ونقلها إلى مقصورات التحت خلوية بعد التحفيز انج الثاني. يتم تمييزها المقصورات التحت خلوية مع الوهم بروتين فلوري أو علامات الفلورسنت الأخرى. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم النهج الأول في توطين المستقبلات في العضيات التحت خلوية مع الحد الادنى من القرار 200 نانومتر من أجل مقارنة تحور مقابل من النوع البري مستقبلات أو للكشف عن التغييرات التالية العلاجات الدوائية. هذه التقنية يمكن الوصول إليها نظرا لأنه يمكن القيام بها في أي المجهر متحد البؤر مجهزة للتصوير الخلايا الحية. السهولة النسبية لهذا النهج يتناقض مع زيادة الخبرة والمعدات اللازمة لتنفيذ الحنق FLIM تقنيات / / BRET الذي كشف عن التفاعلات الجزيئية 6،&quot;XREF&quot;&gt; 11. هذه القياسات تحدد تفاعلات البروتين البروتين بدقة عالية (~ 10 نانومتر) ويستدل توطين داخل عضيات التحت خلوية. وتستخدم هذه التقنيات المتقدمة لمتابعة وزيادة تحديد التفاعلات الجزيئية المصالح، بدلا من المرور من المستقبلات من خلال المقصورات التحت خلوية، وأنها تظهر مباشرة تفاعلات البروتين البروتين في أوقات وأماكن محددة داخل الخلية 11. FLIM، وهي تقنية الحنق مستقلة التركيز متقبل، وغالبا ما تجرى على عينات ثابتة منذ الحصول على الصور أبطأ. في المقابل، يوفر نسبة الحنق التصوير السريع وقرار colocalization عالية من البروتينات التفاعل. العيب من نسبة الحنق هو أن التصوير يستخدم widefield برنامج التحصين الموسع ومضان للحصول على سرعة التصوير وتشمل الخلية بأكملها، مما أدى إلى انخفاض القرار، وعلى النقيض من العضيات 12. نقل تلألؤ بيولوجي الطاقة الرنين (BRET) هو آخرتقنية المتقدمة التي تم تطبيقها على GPCRs لقياس اكتساب القرب الجزيئي على مر الزمن 11. في هذه التقنية يتم تقسيم fluorophore البروتين جزيئيا ويرتبط كل منهما نصف إلى واحد من اثنين من البروتينات في السؤال. عندما اثنين من البروتينات من ربط الفائدة بعضها البعض، وأجزاء من العلامة خيالية تعيد تجميع للحصول على مضان وزيادة مضان كميا مع مرور الوقت. هنا، نقدم تقنية واضحة للتصوير الخلايا الحية إلى جانب الكمي الصورة لدراسة الاتجار AT 1A R في الخلية على التحفيز انج الثاني وتغيير محتمل في تسليم المنضوية AT 1A R لالجسيمات الحالة التالية انج الثاني التحفيز. الاستخدام النهائي لهذه التقنية هو لوصف الاختلافات في الاتجار غشاء مقارنة نوع البرية ومستقبلات تحور. وهذه الاختلافات تساعد على تحديد آلية (ق) التي تؤثر الأنشطة الفسيولوجية للAT 1A R leadiنانوغرام لتنظيم ضغط الدم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotensin II (Ang II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9525&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)&#160;</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Passage number 5 -12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X&#160;</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle medium (DMEM 1X)&#160;</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31053-028</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>molecular probes -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Store aliquotes in dark at -20 &#176;C .&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Visualization and Quantitation Modules</td>
			<td>For 3D image analysis of image stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 AOBS</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>For image collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>For image collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging and 3d analysis of angiotensin receptor type 1a trafficking in transfected human embryonic kidney cells using confocal microscopy

يستخدم التصوير الخلية الحية لالتقاط الصور في وقت واحد في الوقت الفاصل بين مستقبلات الأنجيوتنسين نوع 1A (AT 1A R) ومقصورات داخل الخلايا في الخلايا الجنينية البشرية transfected الكلى 293 (كلوة) بعد التحفيز مع أنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني). و transfected خلايا كلوة عابر مع DNA البلازميد التي تحتوي على AT 1A R ذات الكلمات الدلالية مع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP). يتم تحديد الجسيمات الحالة مع صبغ أحمر فلوري. يتم التقاط الصور الخلية الحية على المجهر متحد البؤر المسح بالليزر بعد التحفيز انج الثاني وتحليلها من قبل البرامج في ثلاثة أبعاد (3D، voxels) مع مرور الوقت. التصوير الخلية الحية يمكن التحقيقات في الاتجار مستقبلات ويتجنب يفند المرتبطة التثبيت، وعلى وجه الخصوص، وفقدان أو النزوح مصطنع من مستقبلات الغشاء EGFP الموسومة. وهكذا، كما يتم تعقب الخلايا الفردية عبر الزمن، وتوطين التحت خلوية من المستقبلات يمكن تصوير وقياس. يجب الحصول على الصور ذلك كافياذ بسرعة لالتقاط الحركة السريعة حويصلة. ومع ذلك، وبسرعة التصوير أسرع، وتخفيض عدد الفوتونات التي تم جمعها. يجب أيضا أن تكون التنازلات في اختيار المعلمات التصوير مثل حجم فوكسل من أجل الحصول على سرعة التصوير. تطبيقات كبيرة من التصوير الخلية الحية هي لدراسة الاتجار البروتين، والهجرة، والانتشار، دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، الالتهام الذاتي والبروتين البروتين التفاعل وديناميكية، على سبيل المثال لا الحصر.

في هذا مجموعة تمثيلية من التجارب، و transfected خلايا كلوة مع مستقبلات الأنجيوتنسين نوع 1A (AT 1A R-GFP) بناء (E1،2،3-AT 1A R) المستنسخة في pEGFP-N2 البلازميد 13. تم الحصول على الصور مرور الزمن من كلوة ولعب كفيلم (انظر لايف التصوير خلية 1 <s...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy at JoVE.co

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

هنا نقدم بروتوكول لخلايا صورة تعبر عن الأخضر الفلورسنت نوع أنجيوتنسين مستقبلات 1A الموسومة البروتين خلال الإلتقام التي بدأها العلاج أنجيوتنسين الثاني. وتتضمن هذه التقنية الجسيمات الحالة وضع العلامات مع علامة فلوري الثانية، ومن ثم استخدام برنامج لتحليل شارك في توطين مستقبلات ويحلول في ثلاثة أبعاد على مر الزمن.

يعيش التصوير خلية وتحليل 3D من أنجيوتنسين مستقبلات نوع 1A الاتجار في خلايا الكلى Transfected الجنينية البشرية عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

فيفو السابقين الثقافة من الفأر الجنينية بالبشرة والتصوير لايف للهجرة أرومة ميلانينية

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

يعيش التصوير خلية من فأر الابتدائية حديثي الولادة العضلية بعد الغدانية وLentiviral تنبيغ طريق متحد البؤر المجهري القرص الغزل

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...