Name: live cell imaging and 3d analysis of angiotensin receptor type 1a trafficking in transfected human embryonic kidney cells using confocal microscopy
Uploaded: 2017-03-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy at JoVE.co

Bu yazıda sunulan araştırma çalışmaları Kathryn Sandberg hibe R01 HL121456-01A1 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri P30-CA051008 tarafından finanse edilmektedir Georgetown Üniversitesi Tıp Merkezi&#39;nde Mikroskopi ve Görüntüleme Paylaşılan Kaynak (MISR) bir Leica SP8 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor kullanılabilirliği ile ek desteklenmiştir. Biz minnetle Leica SP8 görüntüleme Peter Johnson tarafından asistanlığı ve Carl Zeiss Mikroskopi LLC Alma Arnold tarafından sağlanan görüntüleme yardımı ile Georgetown Üniversitesi&#39;nde Thomas Coate, Biyoloji Bölümü laboratuarında Zeiss LSM880 kullanımını kabul. Bu yazıda içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Birinci gün 1. Hücre Yayımlama <ol><li> Tam Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) hazırlayın. fetal bovin serumu (% 10) ile desteklenmiş tam DMEM 500 ml yapmak için DMEM 450 mL fetal sığır serumu, 50 mL, penisilin / streptomisin, 5 ml L-glutamin 5 ml, penisilin / streptomisin (% 1) ve L-glutamin (% 1). </li><li> Tohum insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri, geçit sayısı 6-11 / 50.000 de hiç tam DMEM içinde 8 iyi odacıklı coverglass sisteminde. </li><li> 24 saat boyu...

<ol>
	<li>Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+angiotensin+II+type+1A+receptor+intracellular+retention,+degradation,+and+recycling+by+Rab5,+Rab7,+and+Rab11+GTPases.">Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases.</a> J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).</li><li>Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+angiotensin+II+and+its+AT1+and+AT2+receptors:+evidence+for+selective+sorting+of+receptor+and+ligand.">Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand.</a> Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).</li><li>Hunyady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+PI+3-kinase+dependence+of+early+and+late+phases+of+recycling+of+the+internalized+AT1+angiotensin+receptor.">Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).</li><li>Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+angiotensin+II+in+rat+myometrial+cells.">Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells.</a> Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).</li><li>Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4+and+Rab11+coordinately+regulate+the+recycling+of+angiotensin+II+type+I+receptor+as+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton-dependent+Rab+GTPase-regulated+angiotensin+type+I+receptor+lysosomal+degradation+studied+by+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+prevents+maturation+of+autophagic+vacuoles+by+inhibiting+fusion+between+autophagosomes+and+lysosomes+in+rat+hepatoma+cell+line,+H-4-II-E+cells.">Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells.</a> Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).</li><li>Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+angiotensin+II+activates+rat+myometrium.">Intracellular angiotensin II activates rat myometrium.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).</li><li>Fortian, A., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+reveals+high+stoichiometry+of+Grb2+binding+to+the+EGF+receptor+sustained+during+endocytosis.">Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).</li><li>Aymerich, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+G-protein-coupled+receptor+imaging+to+understand+and+quantify+receptor+dynamics.">Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics.</a> ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).</li><li>Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Detection+of+Diversity+and+Bias+in+GPCR+Function.">Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).</li><li>Inuzuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+ligand-induced+activation+of+angiotensin+II+type+1+receptor+signaling+by+the+type+2+receptor+via+protein+kinase.">Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase.</a> C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+angiotensin+receptor+signaling+through+Erk1/2+pathway+by+a+novel+peptide.">Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Mueller, S. C., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+asialoglycoproteins+by+rat+hepatocytes:+receptor-positive+and+receptor-negative+endosomes.">Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes.</a> J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+Lysotracker+Red+to+a+green+fluorescent+molecule.">Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule.</a> Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).</li><li>Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1,+a+specific+inhibitor+of+vacuolar-type+H(+)-ATPase,+inhibits+acidification+and+protein+degradation+in+lysosomes+of+cultured+cells.">Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells.</a> J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).</li></ol>

Burada sunulan ön deneyler 24 dakika gibi kısa bir sürede boyunca, lizozomlar AT 1a R-GFP teslim kayda değer bir değişiklik meydana geldiğini göstermektedir. Genel olarak, lızozomlara içselleştirilmiş reseptörlerin teslim gibi erken 15-20 dakika olarak meydana gelebilir. Bu deney 1a R AT içselleştirilmiş toplu büyük perinükleer endozomlardan hedeflenmektedir hipotezi ile tutarlıdır. R lizozomlarında geldiğinde 1a AT en azından bazı Li ve arkadaşları ta...

genel amacı, reseptör agonisti ile muamele edildikten sonra zaman ve belirli bir alt-hücresel organel reseptör ko alan sayısal kanıtı elde etmektir. Bu nedenle, burada acil hedefi zaman atlamalı konfokal lizozomlar görüntülerini ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde reseptör (HEK) elde edildi reseptörün yayınlamak için 3 boyutlu görüntüleme verileri transfeksiyonu takiben ve daha sonra bir araya getirmek ve analiz kapsayan bir transmembran yakalamak için lizozomlar. transmembran reseptör fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda nasıl düzenlendiği belirlemenize yardımcı olabilir reseptör ligandı tarafından aktive edildiğinde endositoz sırasında lizozomlar veya diğer organellerin yaptığı bir transmembran reseptör eşzamanlı kaçakçılığının soruşturulmasına. 1a R esas olarak HEK293 1 REC çoğunluğu, ancak örnek hücre sistemleri Ang II ile tedavi sonrası lizozomlar bozunabilen varsayılırligand Ang II kütle lizozom 2, 3, 4, 5 bozulmuş ise eptors özellikle plazma membran daha sonra geri dönüşüm için multiveziküler geri kazanım endozomlarda lokalizedir. Daha yakın zamanda, Li ve diğ. Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve floresan süresi görüntüleme mikroskobu (FLIM) teknikleri kullanılarak ortaya AT 1a R colocalizes LAMP1 ile (~ 10 nM ölçekte) reseptörünün en azından bir kısmı için hedeflenen ve düşer düşündüren bir lizozomal membran proteini lizozomlarında 6 ile. Bu yazarlar lizozomal inhibitörü klorokin klorokin bir etkisi lizozomlarında ile geç endosomes veya autophagosomes füzyon engellemek için olduğunu düşündüren önceki raporlar ile uyumludur 1a R-LAMP1 dernek AT bloke ettiğini kaydetti. Diğer dolaylı yaklaşımlar 1a R l AT belirlemek içinlizozomlarda ocalization, lizozomlarda 3, 4, 5, 6, 7, 8 1a R varlığına anlaması için bir lızozomal inhibitörü bafilomisin kullanmışlardır. Canlı hücre görüntüleme hücre hacmi ve GFP kimerik reseptörün kaybı / karartma / yeniden dağılımı üzerindeki tespitin potansiyel etkilerini önler. Önceki çalışmalar, ko veya lizozomlar veya reseptör bağlayıcı suretlerle ile etiketlenmiş, canlı hücreleri kullanılarak reseptörün eş oluşumunu belirlemek için, sabit hücre bel bağlar β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. dönen disk konfokal veya lazer noktası tarama conf kullanan diğer GPCRs Canlı hücre görüntülemeGaasp veya HYD dedektörleri ile donatılmış Öçal mikroskoplar 30 s aralıklarla 9, 10, z-yığınlarının görüntülü bireysel hücrelerin reseptör içselleştirilmesi ve ticaretini gözlemlemek için araştırmacılar sağladı. Canlı hücre z-yığınları hızla toplanır Ancak bile, analiz sadece 2D 10 yani her yığının içinde tek bir düzlemde seçimden sonra ortaya çıkabilir. Bu soru içselleştirilmiş GPCR veya tirozin kinaz reseptörü çalışmak için yeterli olabilir, AT 1a Rs zamanla boyutunu ve konumunu değiştirmek ve böylece doğal yeterli her zaman bir noktada temsili tek dilim kullanarak örnek daha zor kesecikler birikir. Iyice hücre yoluyla ve boyut ve konumda farklı veziküller her ICSI&#39;nin tespit etmek 1a R AT etiketli rota belirlemek için, 3D görüntüleme ve 3D analizi için bir yöntem bu değişiklikleri izlemek ve olmaya taktığı<html> Bu lizozomlar gibi çeşitli hücre içi bölmelerin etiketleme ile birlikte kullanılır. Müfettişler doğrudan hücre ve Ang II uyarımı aşağıdaki hücre içi bölmelere onun transferi içine AT 1a R hareketini görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme için bu protokolü kullanabilirsiniz. Hücre içi bölmeleri floresan protein kuruntulardan ya da diğer floresan işaretleri ile etiketlenir. Bu protokol, aynı zamanda, vahşi tip reseptörlere karşı mutasyona karşılaştırma ya da farmakolojik tedavi aşağıdaki değişiklikleri tespit etmek için, 200 nm&#39;lik bir çözünürlüğü en az sub-hücresel organellerde reseptörleri lokalize bir ilk yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir konfokal mikroskop gerçekleştirilebilir çünkü tekniğin erişilebilir. Bu yaklaşımın göreli kolaylığı, artan uzmanlık ve moleküler etkileşimleri 6 tespit FRET / flim / BRET teknikleri yürütmek için gerekli ekipman ile çelişmektedir&quot;xref&quot;&gt; 11. Bu ölçümler, yüksek çözünürlüklü (~ 10 nm) ve sub-hücresel organeller içerisinde lokalizasyonu anlaşılmaktadır protein-protein etkileşimlerini tanımlamaktadır. Bunlar daha ileri teknikler takip ve ileri moleküler ilgi etkileşimleri yerine hücre içi bölmeleri sayesinde reseptörlerin geçişini tanımlamak için kullanılır ve doğrudan hücreye 11 içinde belirli zamanlarda ve yerlerde protein-protein etkileşimleri göstermektedir. görüntü elde etme yavaş olduğu FLIM, alıcı konsantrasyonu bağımsız bir FRET tekniği, genellikle sabit bir numune üzerinde gerçekleştirilir. Buna karşılık, bu oran FRET hızlı görüntüleme ve etkileşim proteinlerin yüksek çözünürlüklü ko sağlar. Oran FRET dezavantajı görüntüleme widefield epi-floresan görüntüleme hız kazanmak ve düşük çözünürlükte ve organellerin 12 aksine sonuçlanan tüm hücre içerecek şekilde kullanmaktadır olduğunu. Biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) başka bir şeydirzaman 11 üzerinde moleküler yakınlığı edinilmesini ölçmek için GPCRs uygulanmıştır ileri tekniği. Bu teknikte, bir protein florofor moleküler bölünür ve her yarım, söz konusu iki proteinin birine bağlandı. Ne zaman faiz bağlama iki protein birbirlerine, kimerik etiketinin parçaları floresan ve zamanla sayısal artan floresan elde etmek monte yeniden. Burada, Ang II uyarımı ve Ang II uyarımı aşağıdaki lizozomlar için 1a R AT içselleştirilmiş teslim potansiyel değişim üzerine hücrede AT 1a R ticaretini incelemek için görüntü ölçümü ile birleştiğinde canlı hücre görüntüleme için basit bir teknik sunuyoruz. Bu teknik için nihai kullanımı yabani tip ve mutasyona uğramış reseptörleri karşılaştıran membran kaçakçılığı farklılıkları karakterize etmektir. Bu farklılıklar AT 1a R leadi fizyolojik faaliyetlerini mekanizmasını (ler) etkisini belirlemeye yardımcı olacaktırkan basıncının düzenlenmesi ng.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotensin II (Ang II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9525&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)&#160;</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Passage number 5 -12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X&#160;</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle medium (DMEM 1X)&#160;</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31053-028</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>molecular probes -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Store aliquotes in dark at -20 &#176;C .&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Visualization and Quantitation Modules</td>
			<td>For 3D image analysis of image stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 AOBS</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>For image collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>For image collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging and 3d analysis of angiotensin receptor type 1a trafficking in transfected human embryonic kidney cells using confocal microscopy

Canlı hücre görüntüleme aynı anda anjiotensin II (Ang II) ile uyarılmasını takiben transfekte insan embriyonik böbrek-293 (HEK) hücreleri anjiotensin tip 1a (1a R AT) reseptörleri ve hücre içi bölmelerin zaman atlamalı görüntü yakalamak için kullanılır. HEK hücreleri geçici plazmid DNA gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş 1a R AT içeren transfekte edilir. Lizozomlar kırmızı floresan boya ile tanımlanır. Canlı hücre görüntüleri Ang II uyarıldıktan sonra bir lazer tarama konfokal mikroskop yakalanan ve zamanla üç boyutlu (3D, vokseller) yazılım tarafından analiz edilir. Canlı hücre görüntüleme reseptör kaçakçılığı soruşturma sağlar ve tespit ile ilişkili boşa önler ve özellikle, EGFP etiketli membran reseptörlerinin kaybı veya artefactual deplasman. tek tek hücreler bir süre ile izlenir Böylece, reseptörlerin hücre içi lokalizasyonu görüntülenmiş ve ölçülebilir. Görüntüler sufficientl edinilmesi gerekiry hızla hızlı vezikül hareketini yakalamak için. Bununla birlikte, hızlı bir görüntüleme hızlarda toplandı, fotonların sayısı azalır. Uzlaşmalar da görüntüleme hız kazanmak amacıyla voksel boyutu gibi görüntüleme parametrelerinin seçimi yapılmalıdır. canlı hücre görüntüleme önemli uygulamaları ama bir kaç isim protein kaçakçılığı, göç, çoğalmasını, hücre döngüsü, apoptoz, otofaji ve protein-protein etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için vardır.

Bu deney Örnek setinde, HEK hücreleri pEGFP-N2 plazmit 13 klonlanmıştır (1a R-GFP AT) anjiyotensin tip 1a reseptör yapısı (E1,2,3-1A R) ile transfekte edildi. HEK Time-lapse görüntüleri elde ve bir film (Canlı Hücre Görüntüleme 1 ve Canlı Hücre Görüntüleme 2 film bakınız) olarak çalındı. Film ve fotoğraf ligand uyarılmasından sonra, 1a AT R-EGFPs plazma membranında lok...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy at JoVE.co

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

The overall goal of this experiment is to obtain quantitative spatial and temporal evidence of Angiotensin type one receptor lysosome colocalization after Angiotensin two treatment. This method was devised to detect differences in the subcellular processing of Y type versus mutant receptors, As during the internalization process, that utters in response to ligand simulation. To advantages of this technique are that life cell imaging, eliminates artifacts from fixed and detergent permeabilized cells and that dynamic changes in receptor localization can be assessed in real time.Begin by selecting an appropriate 1.4 numerical aperture objective and centering the objective over the microscope stage. Add a drop of hight viscosity, low auto florescence immersion oil onto the objective and transfer the chamber with the tranfected cells to the microscope stage. Gently raise the objective until the oil just touches the bottom of the first slide and locate the dim cells.With a healthy cell of interest, in the center of the field of view, switch to confocal mode and confirm that the cell is well spread, with its ventral side juxtaposed closely with the cover slip. Open the Z Stack dialog box, click Live, focus on the top of the cell, and then click Begin. Then focus to the bottom of the cell, enter Z step size 1.00 micrometer, and then click End.Then select XYZT Mode under Acquisition settings at the top. Lastly, set the time interval for the scan and the length of time for scanning to observe the targeting of GFP tagged Angiotensin Type 1A Receptor to the lysosomes. Then to begin the ligand stimulation, add three microliters of a 100 X stock solution of ligand to the well that is being imaged and click Start to image the response in 3D for the desired period and frequency.To analyze the live cell images, open the appropriate 3D image quantification software. In this protocol, Velocity. Right click within the image field and select Properties.Enter the appropriate XY and Z image pixel properties for creating a measurement sequence to analyze the GFP tagged receptor vesicle, and hole cell intensities in response to ligand treatment. Under the 2D menu, select the extended focus mode to observe the cell. Next, use the freestyle region tool, to draw a region of interest around the cell, and right click the image to select Crop to Selection.A new image item will be generated. Click on the image name to select the cropped cell image and open the measurement tab. To measure the GFP expression of the internalized vesicles, drag Find Objects from Finding into the sequence box above.Set the find objects channel to GFP and open the settings icon to set the threshold using to standard deviation and the lower limit to six, to select objects with the brightest GFP intensities. Set the minimum object size to zero micrometers cubed. Then, click measure, and select the channels and the types of measurements.To define the thresholding and filters for identifying the whole cell and to measure the total GFP intensity, drag a second Find Objects box. Next, set the Find Objects channel to GFP and set the standard deviation to zero, to select objects with any GFP intensity and minimum object size to two micrometers cubed. Drag Filter Population to the Population two Find Objects box and select a volume of micrometers cubed, greater than 100 to select the whole cell and eliminate all smaller objects.Then, select measurements and Make Measurement item, to make measurement at all time points. To analyze the measured GFP expression in vesicles, and the whole cell over time, click on the measurement item file name below the image name. To extract the data for GFP and vesicles from the total data, open the raw tab and select population one.Then, open the analyzed tab and right clicking on the data, select analysis, followed by restricting analysis to select population one. To measure the amount of GFP in the whole cell, change both to population two. Under Analyze These Data and Summarized By, select sum GFP color channel, and sum.Then, under Organize the data by, and row, select time point. To extract the data for the amount of GFP in lysosomes, in the Find Objects for population one, set the find objects channel to the red channel. In the wheel icon within the dialog box, set the threshold using to standard deviation, the lower limit to six, to select red objects with the brightest intensities, and the minimum object size to 0.017 micrometers cubed.Select measurements, and make make measurement item, to make measurement at all time points. To analyze the measured GFP expression in lysosomes, click on the measurement item file name below the image name. Select population one under the raw tab, and then select population one and sum GFP color channel and sum under the analyze tab, right clicking as before to measure the amount of GFP in the red vesicles.Before ligand stimulation, GFP tagged Angiotensin Type 1A Receptors are localized predominantly in the plasma membrane. But within 2.5 minutes of the addition of Angiotensin two, these receptors become internalized, forming bright vesicles and later clustering and large paranuclearzome vesicles. Angiotensin two induced ruffling complicates the quantification of the total vesicle GFP intensity as observed for these representative GFP expression measurement data.Size filtering does not discriminate between the larger ruffles and clustered vesicles, but does reveal that GFP in smaller objects increases sooner than GFP in larger objects. In this representative time course of GFP expression without autofocus, the internalized GFP was measured as the percent total cellular GFP. Analysis of the total GFP within the cell revealed that this cell did not photo bleach appreciably over time.Quantification of the GFP in the lysosomes of transfected cells also indicates that the intensity of the Angiotensin Type 1A Receptor present within the lysosomes, does not vary for up to 24 minutes after Angiotensin two administration. During this procedure, it's important to remember to monitor the health of the cells prior to and during the imaging, since the procedure is time consuming, the experiment should be aborted if the cell cultures are abnormal in any way. Following this procedure, immunostaining and FRET or FLIM can be used to detect and confirm the subcellular localization of the receptors.Western blots can be performed to address the identity and changes in signaling molecules involved during the receptor trafficking. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform live cell imaging and analysis to measure the ligand induced transmembrane receptor targeting to lysosomes as well as to other subcellular compartments.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...