Name: isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery
Uploaded: 2017-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Forfatterne har ingen bekræftelser.

Blod til isolering af EPC&#39;er blev opnået fra raske frivillige efter informeret samtykke i overensstemmelse med den lokale etiske komité. Serumprøver, der anvendes i migrationen assays blev opnået fra patienter, der undergik konventionel hjertekirurgi med brug af kardiopulmonal bypass (CPB). Eksklusionskriterier var akutte operationer, kendt eller mistænkt graviditet, patientens alder mindre end 18 år, og manglende indhente informeret samtykke. Serumprøver blev udtaget ud over kliniske rutinemæssige målinger...

Den første del af denne undersøgelse omfattede isolering af menneskelige EPC&#39;er fra det perifere blod fra raske frivillige for at muliggøre en omfattende evaluering af blodet af hjerte kirurgi patienter. Derfor blev en densitetsgradientcentrifugering udført for at separere PBMC-fraktionen fra plasma, granulocytter og erythrocytter. At fjerne det meste af de kontaminerende blodplader, var dette cellefraktion udsættes for korte og langsomme vasketrin 29, 30.</s...

<html> Endoteliale progenitorceller (EPC&#39;er) cirkulerer i det menneskelige blod og har evnen til at differentiere til endotelceller 2. De deltager i vaskulogenese og er i stand til at minimere skader forårsaget af betændelse og iskæmi / reperfusion (I / R) skader på forskellige måder 3, 4. For eksempel EPC&#39;er viser forhøjede niveauer af intracellulære antioxidant enzymer såsom katalase, glutathionperoxidase eller mangan superoxid dismutases (MnSOD) 5. Det forhøjede modstand mod oxidativ stress tillader EPC&#39;er at fungere i mikromiljøer med forhøjede reaktive oxygenarter (ROS) efter iskæmisk skade 6. Tidligere undersøgelser viste også, at antallet af EPCs kan være korreleret til vaskulær reparation og at et reduceret antal cirkulerende EPC&#39;er forudsiger forekomsten af kardiovaskulære hændelser 7,class = &quot;xref&quot;&gt; 8. Men er ikke blevet fundet endnu, en klar definition af en EPC. Indtil nu er der ingen specifik celleoverflademarkør eller konsistent fænotype for EPC&#39;er og disse celler er meget sjældne i det perifere blod 9. En menneskelig EPC bør betragtes som en cirkulerende celle med evnen til at bidrage til genopbygningen af ​​de sårede endotel og nye vaskulære strukturer. En måde at isolere og karakterisere EPC&#39;er er gennem adhæsion til fibronectin. Derved er kapaciteten af disse celler anvendes til at vise en overlegen vedhæftning til fibronectin coatede skåle sammenlignet med type 1 collagen, fx 3, 10, 11. Andre fandt imidlertid, at udplade mononukleære celler på fibronectincoatede retter uden forudgående eller yderligere oprensningstrin fører til kolonier herunder myeloide progenitorceller, monocytter og T-lymfocytter 12, 13, 14. Desuden i dette tilfælde kan blodplader forurene det mononukleære celle (MNC) fraktion og derved overføre plasmamembranproteiner eventuelle adhærente celler 15. Udover karakterisering gennem in vitro adhæsionsassays, er en kombination af forskellige celleoverflademarkører bruges til at beskrive en celletype betragtes som en EPC. I dette tilfælde, efter fibronectin-medieret adhæsion, cellerne analyseres om deres endoteliale-lignende egenskaber. I denne proces, de to endotheliale celleassocierede markører, acetyleret-lavdensitetslipoprotein (AcLDL) og vaskulær endotelvækstfaktor receptor 2 (VEGFR-2, KDR), spiller en rolle. Endotelceller og makrofager er blevet vist at specifikt tage op AcLDL i en proces kaldet &quot;scavenger celle pathway&quot; 16. Et andet markørprotein er KDR som den vigtigste VEGF-receptor på endotelceller 17. Men som EPC&#39;er i almindelighed dyrkes i medier suppleret med endotelvækstfaktorer og føtalt kalveserum, er det muligt, at makrofager, der muligvis også er blevet fejlagtigt isoleret, udviser en endothelial-lignende markør profil. Som tidligere vist, hvis dyrkes i en endotel-konditioneret medium, makrofager udtrykker &quot;endoteliale-specifik&quot; proteiner 18. Generelt er der to kategorier af EPC&#39;er inden flere undertyper, som kan findes i blodet eller dyrkes in vitro. Sene-udvækst EPC&#39;er (sen-EPC&#39;er) vises efter 2-3 ugers kultur. Disse celler er integreret hurtigere i et monolag af humane navlestrengsveneendotelceller og kan danne kapillarrør 19. Desuden, såkaldte &quot;early-EPC&#39;er&quot; cirkulerer i blodet i omkring en uge og handle i en mere passiv måde ved at levere angiogene molekyler, såsom vaskulær endotelvækstfaktor(VEGF), eller CXCL8 19. Patienter med koronararteriesygdom (CAD) viste signifikant lavere mængder af tidlige EPC&#39;er sammenlignet med en kontrolgruppe uden CAD 20. Interessant nok viste den samme gruppe større mængder af sene EPC&#39;er sammenlignet med en kontrolgruppe. En anden undersøgelse viste, at tidlig-EPC&#39;er beskytter differentierede EPC&#39;er fra apoptose under oxidative betingelser i en parakrin måde 6. Derfor kan tidlige EPC&#39;er levere relevante beskyttende virkninger gennem migration af andre celler i en auto- eller parakrin måde i perifert blod. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til oprensning af tidlige EPC&#39;er ved først at isolere PBMC-fraktionen fra humant perifert blod og efterfølgende isolering af CD34 + -celler fra PBMC-fraktionen for at rydde denne cellesuspension fra uønskede celler. CD34 er en markør, som anvendes til isolering af humane hæmatopoietiske stamceller 9 </sup&gt;. Bagefter CD34 + -celler dyrkes på fibronectincoatede vævskulturplader overflader. Efter tre dage, ændres mediet, hvorved de mister alle ikke-adhærente celler. Endelig er isolerede EPC&#39;er farves at kontrollere optagelsen af ​​AcLDL og tilstedeværelsen af ​​KDR som endotelcelle-markør ved anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Som en ekstra markering, analyserede vi blodplade endotelcelle-adhæsionsmolekyle (PECAM-1, CD31), som også forekommer på endotelceller. Restaurering af beskadigede eller infarkt myokardie væv ved øget rekruttering af EPC&#39;er hører til de intensivt undersøgte behandlingsstrategier i hjerte-kar-sygdomme. Imidlertid oversættelse af eksperimentelle resultater i klinisk praksis stadig udfordrende på grund af den komplekse cellulære samspil i det menneskelige legeme under forskellige patofysiologiske tilstande. Endvidere myocardial I / R kvæstelser udløse en overdreven sekretion af forskellige cytokiner, hormoner og vækst fac<html> torer, der styrer målsøgning af EPC&#39;er til områder af blodkardannelse 13. Som allerede vist, CXCL8, stromacelle--afledt faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF og makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF) er steget betydeligt i serumprøver efter myokardie I / R skade en. Blandt disse faktorer, MIF er en pleiotropisk chemokin-lignende cytokin med overvejende pro-inflammatoriske egenskaber. I modsætning til sin historiske navn, MIF har pro-migrerende funktioner, som en sand chemokin på forskellige celletyper 1, 21, 22. MIF-medierede celle rekruttering processer er blevet knyttet til kemokinreceptorer CXCR2 og CXCR4, der MIF binder til og aktiverer i en ikke-beslægtet måde 21. Notatet EPC&#39;er udtrykker begge disse receptorer på deres overflade, som desuden bliver opreguleret under hypoxiske betingelserass = &quot;xref&quot;&gt; 23, 24. Desuden, akkumulering tyder på, at MIF har en overordnet cardio-beskyttende virkning under I / R skade af hjertet 22, 25, 26. I den forbindelse er det blevet yderligere vist, at MIF kan understøtte neovaskularisering under hypoxisk stress, der er af særlig relevans, når man overvejer de begrænsede inddrivelse mekanismer skadelidte myocardium 27. Tidligere in vitro-undersøgelser og eksperimenter i prækliniske musemodeller forudsat første beviser om den rolle, MIF i EPC&#39;er rekruttering 4. Notatet MIF også er en fremtrædende last protein EPC&#39;er som kan frigives i løbet af EPC&#39;er rekruttering inden iskæmiske steder 28. Men studier i kliniske omgivelser navnlig i sammenligning med andre (angiogene) serumcytokiner forblive undvigende.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:155px;">L7117</td>
			<td style="width:207px;">Coating of T-75 flasks</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:185px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-22221</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-39226</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">Ficoll-Paque plus</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:207px;">Density centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep human CD34 positive Selection Kit</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18056</td>
			<td style="width:207px;">Isolation of CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep magnet</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18000</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A6964-100ML</td>
			<td style="width:207px;">Detachment of cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Corning HTS transwell 96 well permeable supports</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS3387-8EA</td>
			<td style="width:207px;">Migration system</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hoechst solution</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">33342</td>
			<td style="width:207px;">Staining of migrated cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:185px;">National institutes of health</td>
			<td style="width:155px;">xxx</td>
			<td style="width:207px;">Counting of migrated cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery

Endoteliale progenitorceller (EPC&#39;er) rekrutteres fra knoglemarven under patologiske tilstande som hypoxi og er afgørende involveret i neovaskularisering af iskæmiske væv. Oprindelsen, klassifikation og karakterisering af EPC&#39;er er komplekse; Uanset, er der etableret to fremtrædende undertyper af EPC&#39;er: såkaldt &quot;tidlige&quot; EPC&#39;er (herefter benævnt tidlige-EPC&#39;er) og sene-udvækst EPC&#39;er (sen-EPC&#39;er). De kan klassificeres ved biologiske egenskaber såvel som af deres udseende under in vitro dyrkning. Mens &quot;tidlige&quot; EPC&#39;er vises i mindre end en uge efter dyrkning af perifert blod-afledte mononucleære celler i EF-specifikke medier, kan sene-udvækst EPC&#39;er findes efter 2-3 uger. Late-udvækst EPC&#39;er er blevet anerkendt for at være direkte involveret i neovaskularisering, primært gennem deres evne til at differentiere til modne endotelceller, mens &quot;tidligt&quot; EPC&#39;er udtrykker forskellige angiogene faktorer som Endogenskellige last til fremme angiogenese i en parakrin måde. Under myocardial iskæmi / reperfusion (I / R), forskellige faktorer styrer målsøgning af EPC&#39;er til områder af blodkar- dannelse. Makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF) er et chemokin-lignende pro-inflammatoriske og ubikvitært cytokin og blev for nylig beskrevet at fungere som central regulator af EPC&#39;er migration ved fysiologiske koncentrationer 1. Interessant er MIF opbevaret i intracellulære puljer og kan hurtigt frigives i blodstrømmen efter flere stimuli (f.eks myokardieinfarkt). Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til pålidelig isolering og dyrkning af tidlige EPC&#39;er fra voksent humant perifert blod baseret på CD34-positiv selektion med efterfølgende dyrkning i medium indeholdende endotelvækstfaktorer på fibronectincoatede plader til anvendelse i in vitro migration assays mod serumprøver af hjerte-kirurgiske patienter. Endviderevandrende indflydelse af MIF på kemotaksi af EPC&#39;er sammenlignet med andre kendte angiogenese-stimulerende cytokiner påvises.

Karakterisering af Isolerede endotel progenitorceller Først blev optagelsen af ​​AcLDL verificeret, samt ekspressionen af ​​KDR, og CD31 på overfladen af ​​det isolerede cellepopulation. Som figur 7a viser, 85,1% af de isolerede EPC&#39;er viste en optagelse af AcLDL og udtrykte CD31. Figurerne 7b og 7c viser yderligere en homogen fordeling af begge mærker, selv om...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endoteliale progenitorceller (EPC&#39;er) er afgørende involveret i neovaskularisering af iskæmiske væv. Denne metode beskriver isolering af menneskelige EPC&#39;er fra perifert blod, samt identifikation af deres vandrende potentiale mod serumprøver af hjerte-kirurgiske patienter.

Isolering af endotel progenitorceller fra raske frivillige og deres træk Potential Påvirket af Serum Prøver efter hjertekirurgi

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering af human lymfeendotelceller af Multi-parameter Fluorescens-aktiveret cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering og dyrkning Udvidelse af Tumorspecifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering og dyrkning af Primære endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

En Flow flowcytometri-baserede analyse til måling af membran potentiale i hjerte Myocytes efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

In Vivo Photolabeling af celler i tyktarmen til at vurdere vandrende potentiale af hæmatopoietisk celler i Neonatal mus

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering af atrial Myocytes fra voksne mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Præklinisk model for kardiel donation efter kredsløbssygdomme død

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...