Name: isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery
Uploaded: 2017-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Forfatterne har ingen bekreftelser.

Blood for isolering av EPCs ble hentet fra friske frivillige etter informert samtykke i samsvar med lokale etikkomité. Serumprøver som brukes i migrasjons analysene ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk konvensjonell hjertekirurgi med bruk av kardiopulmonal bypass (CPB). Eksklusjonskriterier var nødoperasjoner, kjent eller mistenkt graviditet, patient`s alder mindre enn 18 år, og unnlatelse av å innhente informert samtykke. Serumprøver ble tatt i tillegg til kliniske rutinemålinger (umiddelbart før operasjo...

Den første delen av denne studien inkluderte isolering av menneskelige EPCs fra perifert blod fra friske frivillige for å muliggjøre en omfattende evaluering av blodet av hjertekirurgi. Derfor ble en tetthetsgradient sentrifugering utført for å separere PBMC fraksjonen fra plasma, granulocytter og erytrocytter. For å fjerne det meste av de forurensende blodplater, ble denne cellefraksjon utsettes for kort og langsom vasketrinn 29, 30. Deretter ble CD34 <su...

<html> Endoteliale progenitorceller (PP-) er sirkulerer i menneskeblod, og har evnen til å differensiere til endotelceller 2. De deltar i vaskulogenese og er i stand til å minimere skader forårsaket av betennelse og iskemi / reperfusjon (I / R) skader på ulike måter 3, 4. For eksempel, EPCs viser forhøyede nivåer av intracellulære antioksidant enzymer som katalase, glutationperoksidase eller mangan superoksyddannende dismutaser (MnSOD) 5. Den forhøyede motstand mot oksidativt stress kan EPCs å fungere i microenvironments med forhøyede reaktive oksygenforbindelser (ROS) etter iskemisk skade seks. Tidligere undersøkelser viste også at antallet EPCs kan bli korrelert til vaskulær reparere, og at et redusert antall sirkulerende EPCs spår forekomst av kardiovaskulære hendelser 7,class = &quot;xref&quot;&gt; 8. Imidlertid har en klar definisjon av en EPC ikke funnet ennå. Opp til nå, er det ingen spesifikk celleoverflaten markør eller konsekvent fenotype for EPCs og disse cellene er svært sjeldne i perifert blod 9. Et menneske EPC bør betraktes som en sirkulerende celle med evnen til å bidra til gjenoppbyggingen av de skadde endotel og nye vaskulære strukturer. En måte å isolere og karakterisere EPCs er gjennom adhesjon til fibronektin. Derved blir kapasiteten av disse cellene brukes for å vise en overlegen adhesjon til fibronektin belagte etter i forhold til type 1 kollagen, for eksempel 3, 10, 11. Men andre funnet at plette mononukleære celler på fibronektin belagt retter uten foregående eller ytterligere rensetrinn fører til kolonier inkludert myeloide stamceller, monocytter og T-lymfocytter 12, 13, 14. Videre, i dette tilfellet, kan blodplatene forurense den mononukleære celler (MNC) fraksjon, og derved overføre plasmamembranproteiner til enhver adherente celler 15. I tillegg til karakteriseringen ved in vitro assays adhesjonsegenskaper, er en kombinasjon av forskjellige celleoverflatemarkører som brukes til å beskrive en celletype betraktes som en EPC. I dette tilfellet, etter fibronektin-mediert adhesjon, blir cellene analyseres vedrørende deres endotel-lignende egenskaper. I denne prosessen, de to endotelcelle-assosierte markører, acetylert-low density lipoprotein (acLDL) og vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR-2, KDR), spille en rolle. Endoteliale celler og makrofager er blitt vist å spesifikt ta opp acLDL i en prosess som kalles &quot;scavenger celle bane&quot; 16. En annen markørprotein er KDR som hoved VEGF-reseptor på endotelcellerceller 17. Men som EPCs generelt dyrkes i medier supplert med endoteliale vekstfaktorer og føtalt kalveserum, er det mulig at makrofager, som også kan ha blitt feilaktig isolert, oppviser en endotelial-lignende markør profil. Som tidligere vist, hvis dyrket i en endothelial kondisjonerte medium, makrofager express &quot;endotelceller spesifikke&quot; proteiner 18. Generelt er det to kategorier av EPCs i flere undergrupper, som kan finnes i blodet eller dyrkes in vitro. Late-utvekst EPCs (sen-EPCs) vises etter 2-3 uker med kultur. Disse cellene er integrert fortere inn i et monolag av humane umbilikalvene endotelceller og kan danne kapillarrør 19. Dessuten, såkalte &quot;tidlig-EPCs&quot; sirkulere i blodet i omtrent en uke og handle på en mer passiv måte gjennom å levere angiogene molekyler, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), eller CXCL8 19. Pasienter med koronarsykdom (CAD) viste signifikant lavere mengder av tidlig EPCs sammenlignet med en kontrollgruppe uten CAD 20. Interessant nok viste det samme gruppe høyere mengder av sen-EPCs sammenlignet med en kontrollgruppe. En annen studie viste at tidlig EPCs beskytte differensierte EPCs fra apoptose etter oksidative betingelser i en parakrint måte 6. Derfor kan tidlige EPCs gi relevante beskyttende effekt gjennom migrasjon av andre celler i en auto- eller parakrint måte innenfor perifert blod. Denne protokollen beskriver en metode for å rense tidlig-EPCs ved først å isolere PBMC-fraksjonen fra humant perifert blod og etterfølgende isolering av CD34 + celler fra PBMC-fraksjonen for å fjerne denne cellesuspensjon fra uønskede celler. CD34 er en markør, som brukes for isolering av humane hematopoietiske stamceller 9 </sup&gt;. Etterpå, CD34 + -celler dyrkes på fibronektin-belagte vevskultur overflater. Etter tre dager blir mediet endret, og dermed miste alle ikke-adherente celler. Endelig er isolerte EPCs farget for å kontrollere opptaket av acLDL og tilstedeværelsen av KDR som endotelial celle-markør ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Som en ekstra markør, analyserte vi blodplate endotelial celleadhesjonsmolekyl (PECAM-1, CD31), som også forekommer på endotelceller. Restaurering av skadet eller infarkt hjerteinfarkt vev av økt rekruttering av EPCs tilhører intensivt undersøkte behandlingsstrategier i hjerte- og karsykdommer. Imidlertid er oversettelsen av eksperimentelle resultater til klinisk praksis fortsatt krevende, gitt det komplekse cellulære samspillet i menneskekroppen under forskjellige patofysiologiske tilstander. Videre er det myokardiale I / R-skade utløse en overdreven utskilling av forskjellige cytokiner, hormoner og vekst fac<html> torer, som styrer homing av EPCs til regioner av blodkardannelse 13. Som allerede vist, CXCL8, stromal celle-avledet faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF og makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF) er betydelig økt i serumprøver etter hjerteinfarkt I / R skade en. Blant disse faktorene, er en pleiotropisk MIF kjemokin-lignende cytokin med overveiende pro-inflammatoriske egenskaper. I motsetning til sin historiske navn, har MIF pro-trekkende funksjoner, fungerer som en sann chemokin på ulike celletyper 1, 21, 22. MIF-mediert celle rekrutteringsprosesser har vært knyttet til kjemokinreseptorer CXCR2 og CXCR4, som MIF binder seg til og aktiverer i et ikke-beslektet måte 21. Av notatet, EPCs uttrykker begge disse reseptorene på overflaten, som i tillegg blir oppregulert etter hypoksiske betingelserass = &quot;xref&quot;&gt; 23, 24. Dessuten foreslår akkumulerende bevis for at MIF har en samlet kardio-beskyttende effekt under I / R-skade av hjertet 22, 25, 26. I denne sammenheng har det blitt ytterligere vist at MIF kan støtte neovascularization under hypoksisk stress som er spesielt relevant, da vurderer begrenset mekanismer for gjenoppretting av den skadde hjertemuskelen 27. Tidligere in vitro-studier og eksperimenter i pre-kliniske musemodeller gitt første bevis om rollen til MIF i EPCs rekruttering fire. Av notatet, MIF også er en fremtredende last protein av EPCs som kan bli lansert i løpet av EPCs rekruttering innen iskemiske områder 28. Men studier i kliniske settinger spesielt i sammenligning med andre (angiogene) serumcytokinene forblir unnvikende.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:155px;">L7117</td>
			<td style="width:207px;">Coating of T-75 flasks</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:185px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-22221</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-39226</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">Ficoll-Paque plus</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:207px;">Density centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep human CD34 positive Selection Kit</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18056</td>
			<td style="width:207px;">Isolation of CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep magnet</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18000</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A6964-100ML</td>
			<td style="width:207px;">Detachment of cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Corning HTS transwell 96 well permeable supports</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS3387-8EA</td>
			<td style="width:207px;">Migration system</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hoechst solution</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">33342</td>
			<td style="width:207px;">Staining of migrated cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:185px;">National institutes of health</td>
			<td style="width:155px;">xxx</td>
			<td style="width:207px;">Counting of migrated cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery

Endoteliale progenitorceller (EPCs) er rekruttert fra benmargen henhold patologiske tilstander som hypoksi og er avgjørende involvert i neovascularization av iskemiske vev. Opprinnelse, klassifisering og karakterisering av EPCs er komplekse; til tross, er det etablert to fremtredende under typer EPCs: såkalt &quot;tidlig&quot; EPCs (heretter benevnt tidlig-EPCs) og sen-utvekst EPCs (sen-EPCs). De kan klassifiseres ved biologiske egenskaper, så vel som ved sin opptreden under in vitro kultur. Mens &quot;tidlig&quot; EPCs vises på mindre enn en uke etter kultur av perifert blod-avledet mononukleære celler i EF-spesifikke media, kan sen-utvekst EPCs bli funnet etter 2-3 uker. Late-utvekst EPCs har vært kjent for å være direkte involvert i neovascularization, hovedsakelig gjennom sin evne til å differensiere til modne endotelceller, mens &quot;tidlig&quot; EPCs uttrykke ulike angiogene faktorer som EndogenOUS last for å fremme angiogenese i en parakrint måte. Under myokardiskemi / reperfusjon (I / R), ulike faktorer kontrollere homing av EPCs til regioner av blodkardannelse. Makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF) er en chemokin-lignende pro-inflammatorisk og allestedsnærværende uttrykt cytokin og ble nylig beskrevet å fungere som sentrale regulator av EPCs migrasjon ved fysiologiske konsentrasjoner 1. Interessant er MIF lagret i intracellulære bassenger og kan raskt bli sluppet ut i blodet etter flere stimuli (f.eks hjerteinfarkt). Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for pålitelig isolasjon og kultur av tidlig-EPCs fra voksent humant perifert blod basert på CD34-positiv utvelgelse med påfølgende kultur i medium inneholdende endoteliale vekstfaktorer for fibronektin-belagte plater for anvendelse i in vitro-migrasjons analyser mot serumprøver av hjerte kirurgiske pasienter. Viderevandrende innflytelse av MIF på kjemotaksen av EPCs sammenlignet med andre kjente angiogenese-stimulerende cytokiner er demonstrert.

Karakterisering av isolerte endotel stamceller Først ble opptaket av acLDL verifisert, så vel som ekspresjon av KDR, og CD31 på overflaten av den isolerte cellepopulasjon. Som figur 7a viser, 85,1% av de isolerte EPCs viste opptak av acLDL og uttrykt CD31. Figurene 7b og 7c viser videre en homogen fordeling av hvert merke, selv om det synes å være en mindre populasjon, negat...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endoteliale progenitorceller (PP-) er avgjørende involvert i neovaskularisering av ischemiske vev. Denne fremgangsmåten beskriver isoleringen av humane EPCs fra perifert blod, i tillegg til identifikasjon av deres vandrings potensial mot serumprøver av hjerte kirurgiske pasienter.

Isolering av endothelial stamceller fra friske frivillige og deres trekkende Potential påvirket av serumprøver etter hjerteoperasjon

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Fremstilling og<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av magnetisert mir-modifisert endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

En flyt cytometri-baserte analysen for å måle mitokondrie membran potensial i hjerte myocytter etter hypoksi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

I Vivo Photolabeling celler i tykktarmen å vurdere vandrende potensialet i blodkreft cellene i Neonatal mus

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av atrieflimmer myocytter fra voksen mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Pre-klinisk modell av CARDIAC donasjon etter sirkulasjonssystemet Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...