Name: isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery
Uploaded: 2017-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Os autores não têm confirmações.

Sangue para o isolamento de EPCs foi obtido de voluntários saudáveis ​​após consentimento informado, de acordo com o comitê de ética local. As amostras de soro usados ​​nos ensaios de migração foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca convencional com o uso de circulação extracorpórea (CEC). Os critérios de exclusão foram operações de emergência, gravidez conhecida ou suspeita, do doente idade inferior a 18 anos, e falha na obtenção de consentimento informado. As amostras de so...

A primeira parte deste estudo incluiu o isolamento de EPCs humanos do sangue periférico de voluntários saudáveis ​​para permitir uma avaliação completa do sangue de pacientes de cirurgia cardíaca. Portanto, uma centrifugação em gradiente de densidade foi realizada para separar a fracção de PBMC a partir de plasma, granulócitos e eritrócitos. Para remover a maioria dos contaminantes plaquetas, célula esta fracção foi submetida a curto e lavagem lenta os passos 29, <su...

<html> As células progenitoras endoteliais (CPE) estão em circulação no sangue humano e têm a capacidade de se diferenciarem em células endoteliais 2. Eles participam na vasculogénese e são capazes de minimizar o dano causado por ferimentos inflamação e isquemia / reperfusão (I / R) de várias maneiras, 3 4. Por exemplo, EPCs mostram níveis elevados de enzimas antioxidantes intracelular, tal como a catalase, glutationa peroxidase ou superóxido dismutase de manganês (MnSOD) 5. A elevada resistência contra o estresse oxidativo permite EPCs para funcionar em microambientes com espécies elevados reactivas de oxigénio (ROS) após a lesão isquêmica 6. Estudos anteriores indicaram que também o número de CPE pode ser correlacionada com a reparação vascular e que um número reduzido de circulantes EPCs prevê a ocorrência de eventos cardiovasculares 7,class = &quot;xref&quot;&gt; 8. No entanto, uma definição clara de um EPC ainda não foi encontrado. Até agora, não existe um marcador da superfície celular específico ou fenótipo consistente para CPE e estas células são muito raros no sangue periférico 9. Um EPC humana deve ser considerada como uma célula de circulação com a capacidade de contribuir para a reconstrução do endotélio lesionado e novas estruturas vasculares. Uma maneira de isolar e caracterizar EPCs é através da adesão à fibronectina. Deste modo, a capacidade destas células é utilizado para mostrar uma aderência superior à fibronectina pratos revestidos em comparação com um tipo de colagénio, por exemplo, 3, 10, 11. No entanto, outros descobriram que o plaqueamento de células mononucleares em pratos revestidos com fibronectina sem qualquer passo de purificação anterior ou ainda leva a colónias incluindo células progenitoras mielóides, monócitos e linfócitos T 12, 13, 14. Além disso, neste caso, as plaquetas podem contaminar a fracção de células mononucleares (MNC) e transferir, assim, proteínas de membrana de plasma de todas as células aderentes 15. Além da caracterização através de ensaios in vitro de adesão, uma combinação de diferentes marcadores de superfície de células é utilizado para descrever um tipo de célula considerado como um EPC. Neste caso, após a adesão mediada por fibronectina, as células são analisadas quanto ao atributos de tipo endotelial. Neste processo, os dois marcadores associados às células endoteliais, de lipoproteínas acetiladas de baixa densidade (AcLDL) e vascular do receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR-2, KDR), desempenham um papel. As células endoteliais e macrófagos foram mostrados para tomar-se especificamente AcLDL em um processo chamado de &quot;via celular sequestrante&quot; 16. Outra proteína marcadora é KDR como o principal receptor de VEGF em endotelialAs células 17. No entanto, como EPCs em geral, são cultivadas em meio suplementado com factores de crescimento endoteliais e soro fetal de vitela, é possível que os macrófagos, que também pode ter sido erroneamente isolado, exibem um perfil de marcadores de tipo endotelial. Como foi mostrado anteriormente, se cultivadas em um meio com ar-endotelial, macrófagos expressam proteínas &quot;específico-endoteliais&quot; 18. Em geral, existem duas categorias de EPCs dentro mais subtipos, os quais podem ser encontrados no sangue ou ser cultivadas in vitro. EPCs final-excrescência (late-EPCs) aparecem após 2-3 semanas de cultura. Estas células são integrados mais rápido para uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana e pode formar tubos capilares 19. Além disso, os chamados &quot;Early-EPCs&quot; circulam no sangue para cerca de uma semana e agir de uma maneira mais passiva através da realização moléculas angiogénicas, tais como crescimento endotelial vascularfator (VEGF), ou CXCL8 19. Os pacientes com doença arterial coronariana (DAC) mostrou valores significativamente mais baixos de early-EPCs em comparação a um grupo controle sem DAC 20. Curiosamente, o mesmo grupo demonstrou valores mais elevados de final-EPCs em comparação com um grupo de controlo. Outro estudo mostrou que early-EPCs proteger CPE diferenciadas da apoptose em condições oxidantes, de uma forma parácrina 6. Portanto, os primeiros EPCs pode proporcionar efeitos protectores relevantes através da migração de outras células de uma forma automática ou parácrina dentro do sangue periférico. Este protocolo descreve um método para purificar primeiros-EPCs em primeiro lugar isolar as PBMC-fracção a partir de sangue periférico humano e, subsequentemente, isolar as células CD34 + a partir de PBMC-fracção para limpar esta suspensão de células a partir de células não desejadas. O CD34 é um marcador, o qual é utilizado para o isolamento de células-tronco hematopoiéticas humanas 9 </sup&gt;. Em seguida, as células CD34 + são cultivadas em superfícies de cultura de tecidos revestidas com f ibronectina. Depois de três dias, o meio é mudado, perdendo assim todas as células não-aderentes. Finalmente, CPE isoladas são coradas para verificar a absorção de AcLDL e a presença de células endoteliais como KDR-marcador usando células activadas por fluorescência (FACS). Como um marcador adicional, analisamos molécula endotelial de adesão celular das plaquetas (PECAM-1, CD31), que também ocorre em células endoteliais. Restauração do tecido do miocárdio danificado ou infartados pela maior recrutamento de EPCs pertence às estratégias de tratamento intensamente investigadas em doenças cardiovasculares. No entanto, a tradução de resultados experimentais para a prática clínica é ainda difícil, dado o complexo interacção celular no corpo humano durante várias condições fisiopatológicas. Além disso, o miocárdio I / R lesões desencadear uma secreção excessiva de diversas citoquinas, hormonas e FAC crescimento<html> res, que controlam a homing de EPCs a regiões de formação de vasos sanguíneos 13. Tal como já foi mostrado, CXCL8, derivado de células do estroma fator 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF e factor inibidor da migração de macrófagos (MIF) estão significativamente aumentados em amostras de soro após lesão miocárdica de I / R 1. Entre esses fatores, MIF é uma citocina quimiocinas-like pleiotropic com características predominantemente pró-inflamatórias. Em contraste com o seu nome histórico, MIF tem funções pró-migratórios, actuando como uma verdadeira quimiocina em vários tipos de células de 1, 21, 22. Processos de recrutamento celular de MIF-mediadas foram ligados ao receptores de quimioquinas CXCR4 e CXCR2, que MIF se liga e activa de uma forma não-cognato 21. De nota, EPCs expressar ambos estes receptores na sua superfície, o qual, adicionalmente, tornam-se-reguladas sob condições hipóxicasass = &quot;xref&quot;&gt; 23, 24. Além disso, evidências acumuladas sugerem que MIF tem um efeito global cardio-protector durante a lesão de I / R do coração 22, 25, 26. Neste contexto, foi ainda demonstrado que MIF pode apoiar a neovascularização durante o estresse hipóxico que é de particular relevância, quando se analisam os mecanismos de recuperação limitadas do miocárdio lesado 27. Anteriores estudos in vitro e experiências em modelos pré-clínicos de rato fornecida primeira evidência sobre o papel da MIF no EPCs recrutamento 4. De nota, MIF também é uma proteína de carga proeminente de EPCs que pode ser introduzida durante o recrutamento EPCs dentro de sites isquêmicas 28. No entanto, estudos em ambientes clínicos, em especial em comparação com outros (angiogênicas) citocinas séricas permanecem ainda desconhecidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:155px;">L7117</td>
			<td style="width:207px;">Coating of T-75 flasks</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:185px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-22221</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-39226</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">Ficoll-Paque plus</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:207px;">Density centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep human CD34 positive Selection Kit</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18056</td>
			<td style="width:207px;">Isolation of CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep magnet</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18000</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A6964-100ML</td>
			<td style="width:207px;">Detachment of cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Corning HTS transwell 96 well permeable supports</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS3387-8EA</td>
			<td style="width:207px;">Migration system</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hoechst solution</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">33342</td>
			<td style="width:207px;">Staining of migrated cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:185px;">National institutes of health</td>
			<td style="width:155px;">xxx</td>
			<td style="width:207px;">Counting of migrated cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery

As células progenitoras endoteliais (CPE) são recrutadas a partir da medula óssea em condições patológicas como a hipóxia e são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. A origem, classificação e caracterização de EPCs são complexas; Não obstante, dois sub-tipos importantes de EPCs foram estabelecidas: os chamados &quot;early&quot; EPCs (posteriormente referido como primeiros-EPCs) EPCs e tardio-excrescência (late-EPCs). Eles podem ser classificados pelo propriedades biológicas, bem como pela sua aparência durante a cultura in vitro. Enquanto EPCs &quot;precoces&quot; aparecem em menos de uma semana depois de a cultura de células mononucleares derivadas de sangue periférico em meios-CE específico, EPCs de fim de conseqüência pode ser encontrado após 2-3 semanas. EPCs Late-desdobramento ter sido reconhecido como estando directamente envolvido na neovascularização, principalmente através da sua capacidade de se diferenciar em células endoteliais maduras, enquanto que &quot;cedo&quot; EPCs expressar vários fatores angiogênicos como endógenaous carga para promover a angiogénese de um modo parácrino. Durante miocárdio a isquemia / reperfusão (I / R), vários factores controlar o homing de CPE para as regiões de formação de vasos sanguíneos. Factor de inibição de migração de macrófagos (MIF) é uma citocina pró-inflamatória e ubiquamente expresso quimiocina-e como foi recentemente descrito como a função do regulador chave da migração EPCs em concentrações fisiológicas 1. Curiosamente, MIF é armazenado em piscinas intracelulares e pode rapidamente ser liberado na corrente sanguínea após vários estímulos (por exemplo, enfarte do miocárdio). Este protocolo descreve um método para o isolamento seguro e cultura de início-EPCs a partir de sangue periférico humano adulto com base na selecção de células CD34-positivas com a cultura subsequente em meio contendo factores de crescimento endoteliais em placas revestidas com fibronectina para utilização em ensaios in vitro de migração contra amostras de soro dos pacientes cirúrgicos cardíacos. Além disso, oinfluência migratória de MIF em quimiotaxia de EPCs em comparação com outras citocinas de estimulação de angiogénese bem conhecido é demonstrada.

Caracterização de isolados células endoteliais progenitoras Em primeiro lugar, a absorção de AcLDL foi verificado, bem como a expressão de KDR, e CD31 sobre a superfície da população de células isoladas. Como mostra a figura 7A, 85,1% dos EPCs isoladas mostrou uma absorção de AcLDL e expressou CD31. As Figuras 7b e 7c mostram, adicionalmente, uma distribuição homog?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

As células progenitoras endoteliais (CPE) são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. Este método descreve o isolamento de EPCs humanos a partir de sangue periférico, bem como a identificação do seu potencial migratório contra amostras de soro de pacientes de cirurgia cardíaca.

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Medicina

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Modelo pré-clínico de doação cardíaca após a morte circulatória

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca