Name: isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery
Uploaded: 2017-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Författarna har inga bekräftelser.

Blod för isolering av EPC erhölls från friska frivilliga efter informerat samtycke i enlighet med den lokala etiska kommittén. Serumprover som användes i migrationsanalyser erhölls från patienter som genomgick konventionell hjärtkirurgi med användning av hjärt-lungbypass (CPB). Uteslutningskriterier var katastrofinsatser, känd eller misstänkt graviditet, patient`s ålder mindre än 18 år, och misslyckas med att erhålla informerat samtycke. Serumprover togs utöver kliniska rutinmätningar (omedelbart före...

Den första delen av denna studie ingick isolering av mänskliga EPC från perifert blod från friska frivilliga för att möjliggöra en omfattande utvärdering av blod hjärtkirurgpatienter. Därför gjordes en densitetsgradient centrifugering utförs för att separera den PBMC-fraktionen från plasma, granulocyter och erytrocyter. Att avlägsna det mesta av de kontamine trombocyter, var detta cellfraktionen utsattes för kort och långsamma tvättningssteg 29, 30.<...

<html> Endoteliala progenitorceller (EPC) cirkulerar i humant blod och har förmågan att differentiera till endotelceller 2. De deltar i vaskulogenes och har förmåga att minimera de skador som orsakas av inflammation och ischemi / reperfusion (I / R) skador på olika sätt 3, 4. Till exempel, EPC visar förhöjda halter av intracellulära antioxidantenzymer som katalas, glutationperoxidas eller mangan superoxiddismutaser (MnSOD) 5. Den förhöjda motstånd mot oxidativ stress kan EPC att fungera i mikromiljöer med förhöjda reaktiva syreradikaler (ROS) efter ischemisk skada 6. Tidigare studier visade också att antalet EPC kan korreleras till vaskulär reparation och att ett minskat antal cirkulerande EPC förut förekomsten av kardiovaskulära händelser 7,class = &quot;xref&quot;&gt; 8. Emellertid har en tydlig definition av en EPC inte hittats ännu. Hittills finns det ingen särskild cellytan markör eller konsekvent fenotyp för EPC och dessa celler är mycket sällsynta i det perifera blodet 9. En mänsklig EPC bör betraktas som ett cirkulerande cell med förmåga att bidra till återuppbyggnaden av den skadade endotel och nya kärlstrukturer. Ett sätt att isolera och karakterisera EPC är genom vidhäftning till fibronektin. Därigenom är förmågan hos dessa celler används för att visa en överlägsen vidhäftning till fibronektin belagda rätter jämfört med typ 1 kollagen, till exempel 3, 10, 11. Men andra fann att plätering mononukleära celler på fibronektinbelagda rätter utan någon föregående eller ytterligare reningssteg leder till kolonier inklusive myeloida progenitorceller, monocyter och T-lymfocyter 12, 13, 14. Dessutom, i detta fall, kan trombocyter förorena mononukleära cell (MNC) fraktionen och därmed överföra plasmamembranproteiner till eventuella vidhäftande celler 15. Förutom karakterisering genom in vitro-vidhäftningsanalyser, är en kombination av olika markörer på cellytan som används för att beskriva en celltyp betraktas som en EPC. I detta fall, efter fibronektin-förmedlad vidhäftning, cellerna analyseras angående deras endotel-liknande attribut. I denna process, de två endoteliala cellassocierade markörer, acetylerad-lågdensitetslipoprotein (AcLDL) och vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor 2 (VEGFR-2, KDR), spela en roll. Endotelceller och makrofager har visat sig särskilt ta upp AcLDL i en process som kallas &quot;renhållare cellvägen&quot; 16. En annan markörproteinet är KDR som huvud VEGF-receptor på endotelcellerceller 17. Emellertid, som EPCs i allmänhet odlas i media som kompletterats med endoteliala tillväxtfaktorer och fetalt kalvserum, är det möjligt att makrofager, som kanske även har felaktigt isolerade, uppvisar en endotel-liknande markör profil. Som tidigare visats, om odlas i ett endotel-konditionerat medium, makrofager uttrycker &quot;endotelceller specifika&quot; proteiner 18. I allmänhet finns det två kategorier av EPCs inom flera subtyper, vilka återfinns i blodet eller odlas in vitro. Sena-utväxt EPC (sent EPC) visas efter 2-3 veckors odling. Dessa celler är integrerade snabbare i ett monoskikt av humana navelvenendotelceller och kan bilda kapillärrör 19. Dessutom, så kallade &quot;early-EPCs&quot; cirkulerar i blodet i ungefär en vecka och agera på ett mer passivt sätt genom att leverera angiogena molekyler, såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor(VEGF), eller CXCL8 19. Patienter med kranskärlssjukdom (CAD) uppvisade signifikant lägre halter av tidiga-EPCs jämfört med en kontrollgrupp utan CAD 20. Intressant nog visade samma grupp högre mängder av sena-EPCs jämfört med en kontrollgrupp. En annan studie visade att tidig EPC skydda differentierade EPC från apoptos under oxidativa förhållanden parakrin sätt 6. Därför kan tidiga EPC ge relevanta skyddande effekter genom migration av andra celler i en auto- eller parakrina sätt i det perifera blodet. Detta protokoll beskriver en metod för att rena tidiga-EPCs genom att först isolera PBMC-fraktionen från humant perifert blod och därefter isolera CD34 + celler från PBMC-fraktionen för att rensa denna cellsuspension från oönskade celler. CD34 är en markör, som används för isoleringen av humana hematopoietiska stamceller 9 </sup&gt;. Efteråt, CD34 + celler odlas på fibronektinbelagda vävnadsodlingsytor. Efter tre dagar, byts mediet och därmed förlora alla icke-vidhäftande celler. Slutligen är isolerade EPCs färgas för att kontrollera upptagningen av AcLDL och närvaron av KDR som endotelial cellmarkör genom användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Som en ytterligare markör, analyserade vi blodplätts endotelial celladhesionsmolekyl (PECAM-1, CD31), som också förekommer på endotelceller. Restaurering av skadade eller infarkthjärtmuskelvävnaden genom ökad rekrytering av EPC hör till de intensivt undersökta behandlingsstrategier i hjärt- och kärlsjukdomar. Det är dock fortfarande en utmaning översättning av experimentella resultat i klinisk praxis, med tanke på den komplexa cellulära samspelet i människokroppen under olika patofysiologiska förhållanden. Dessutom myocardial I / R skador utlöser en överdriven utsöndring av olika cytokiner, hormoner och tillväxt FAC<html> torer, som styr målsökande av EPCs till regioner i blodkärlsbildning 13. Som redan visats, CXCL8, stromal derived faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF och migration av makrofager hämmande faktor (MIF) är signifikant ökad i serumprov efter hjärtinfarkt I / R skada en. Bland dessa faktorer, är MIF en pleiotrop kemokin liknande cytokin med övervägande pro-inflammatoriska egenskaper. I motsats till dess historiska namn, har MIF pro-flyttande funktioner, i egenskap av en sann kemokin på olika celltyper 1, 21, 22. MIF-medierade cellrekryteringsprocesser har varit kopplade till kemokinreceptorer CXCR2 och CXCR4, vilket MIF binder till och aktiverar på ett icke-besläktat sätt 21. Notera EPC uttrycka båda dessa receptorer på sin yta, som dessutom blir uppregleras under hypoxiska betingelserass = &quot;xref&quot;&gt; 23, 24. Dessutom föreslår ackumulera bevis för att MIF har en övergripande hjärt-skyddande effekt under I / R skada av hjärtat 22, 25, 26. I detta sammanhang har det visat sig vidare att MIF kan stödja kärlnybildning under hypoxisk stress som är av särskild betydelse, när man överväger de begränsade mekanismerna för återvinning av skadade hjärtmuskeln 27. Tidigare in vitro-studier och experiment i prekliniska musmodeller tillhandahålls första bevis om rollen av MIF i EPC rekrytering 4. Notera, är MIF också en framträdande last protein av EPC som får släppas ut under EPC rekrytering inom ischemiska platser 28. Men studier i kliniska inställningar, särskilt i jämförelse med andra (angiogena) serum cytokiner förblir gäckande.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:155px;">L7117</td>
			<td style="width:207px;">Coating of T-75 flasks</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:185px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-22221</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix</td>
			<td style="width:185px;">Promo Cell</td>
			<td style="width:155px;">C-39226</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">Ficoll-Paque plus</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:155px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:207px;">Density centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep human CD34 positive Selection Kit</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18056</td>
			<td style="width:207px;">Isolation of CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">EasySep magnet</td>
			<td style="width:185px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:155px;">18000</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A6964-100ML</td>
			<td style="width:207px;">Detachment of cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Corning HTS transwell 96 well permeable supports</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS3387-8EA</td>
			<td style="width:207px;">Migration system</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hoechst solution</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">33342</td>
			<td style="width:207px;">Staining of migrated cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:185px;">National institutes of health</td>
			<td style="width:155px;">xxx</td>
			<td style="width:207px;">Counting of migrated cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial progenitor cells from healthy volunteers and their migratory potential influenced by serum samples after cardiac surgery

Endotelceller progenitorceller (EPC) rekryteras från benmärgen i patologiska tillstånd som hypoxi och avgörande inblandade i kärlnybildning av ischemiska vävnader. Ursprunget, klassificering och karakterisering av EPC är komplexa; Trots har två framstående subtyper av EPCs fastställts: så kallade &quot;tidiga&quot; EPC (nedan kallad tidig-EPC) och sent utväxt EPC (sent EPC). De kan klassificeras med biologiska egenskaper liksom av deras utseende under in vitro kultur. Medan &quot;tidiga&quot; EPC visas i mindre än en vecka efter odling av perifera blodhärledda mononukleära celler i EG-specifika medier, kan sen utväxt EPC hittas efter 2-3 veckor. Sen utväxt EPC har erkänts vara direkt involverade i kärlnybildning, främst genom sin förmåga att differentiera till mogna endotelceller, medan &quot;tidiga&quot; EPC uttrycka olika angiogena faktorer som Endogengare last för att främja angiogenes på ett parakrint sätt. Under ischemi / reperfusion (I / R), olika faktorer styr målsökande av EPC till regioner av blodkärlsbildning. Migration av makrofager hämmande faktor (MIF) är en kemokin liknande pro-inflammatoriska och allmänt utbrett uttryckt cytokin och beskrevs nyligen att fungera som nyckelregulator för EPC migration vid fysiologiska koncentrationer 1. Intressant är MIF lagras i intracellulära pooler och kan snabbt släppas ut i blodet efter flera stimuli (t.ex. hjärtinfarkt). Detta protokoll beskriver en metod för tillförlitlig isolering och odling av tidiga-EPCs från vuxen human perifert blod baserat på CD34-positiv selektion med efterföljande odling i medium innehållande endoteliala tillväxtfaktorer på fibronektinbelagda plattor för användning i in vitro-migrationsanalyser mot serumprover av hjärt kirurgiska patienter. Dessutommigratory påverkan av MIF på kemotaxi av EPCs jämfört med andra välkända angiogenesstimulerande cytokiner demonstreras.

Karakterisering av isolerade endoteliala progenitorceller Först upptaget av AcLDL kontrolleras, liksom uttrycket av KDR, och CD31 på ytan av den isolerade cellpopulationen. Som Figur 7a visar, 85,1% av de isolerade EPC visade ett upptag av AcLDL och uttryckte CD31. Figurerna 7b och 7c visar vidare en homogen fördelning av båda markörerna, även om det verkar vara en mindre b...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery at JoVE.com

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endotelceller progenitorceller (EPC) är avgörande inblandade i kärlnybildning av ischemiska vävnader. Denna metod beskriver isolering av mänskliga EPC från perifert blod, liksom fastställandet av deras migrations potential mot serumprover av hjärt kirurgiska patienter.

Isolering av Endothelial stamceller från friska frivilliga och flyttning Potential Influenser serumprover efter hjärtkirurgi

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av Human Lymphatic endotelceller från Multi-parameter fluorescensaktiverad cellsortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering och odling Expansion av Tumörspecifika endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering och odling av primära endotelceller från Canine artärer och vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

framställning och<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av Magnetized miR-modifierade endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Ett flöde flödescytometri-baserad analys för att mäta mitokondriella membranet Potential i hjärt myocyter efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

In Vivo Photolabeling av cellerna i tjocktarmen att bedöma flyttande potentialen för hematopoetiska celler hos neonatala möss

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av Förmaksmyocyter från vuxna möss

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Preklinisk modell av hjärt donation efter cirkulatorisk död

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...