Name: development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Wij danken Drs. Betty Wu-Hsieh en Chien-Kuo Lee bij NTU, Leigh Zerboni aan de Stanford University en Dr. Peter Hoffmann aan de Universiteit van Hawaii voor het lezen van het manuscript, Yun Chien bij NTU voor technische bijstand, en Dr Wen-Chi Wei op landbouw biotechnologie Research Center bij Academia Sinica voor technisch advies.

Vrouwelijke muizen met 8 - 12 weken oud werden gebruikt voor deze studie. C57 / BL6 wildtype (WT) en IL-15 deficiënte (IL-15 - / -) muizen werden gekocht bij National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan en Taconic Farm resp. IL-15-deficiënte (IL-15 - / -) en IL-15-dominante (+/- IL15 en IL15 + / +) toonde een 1: 3 verhouding in de tweede generatie van het kruis van IL-15 +/- heterozygoten. Het genotype van IL-15 - / - muizen werd bevestigd door PCR-a...

<ol>
	<li>Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cytokines+in+murine+cutaneous+irritant+responses.">Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses.</a> Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nature reviews. 9, 679-691 (2009).</li><li>Liu, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+application+of+HIV+DNA+vaccine+with+cytokine-expression+plasmids+induces+strong+antigen-specific+immune+responses.">Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses.</a> Vaccine. 20, 42-48 (2001).</li><li>Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+application+of+viral+vectors+for+epidermal+gene+transfer.">Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer.</a> J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).</li><li>Partidos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+vaccines+into+the+skin+without+needles+and+syringes.">Delivering vaccines into the skin without needles and syringes.</a> Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).</li><li>Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+DNA+through+the+skin.">Immunization with DNA through the skin.</a> Methods. 31, 232-242 (2003).</li><li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment.">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).</li><li>Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+immunization+is+a+simple+method+for+eliciting+an+immune+response.">Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.</a> Nature. 356, 152-154 (1992).</li><li>Haynes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-mediated+DNA+vaccine+delivery+to+the+skin.">Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).</li><li>Tuomela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+general+safety+of+a+naked+DNA+plasmid,+GTU-MultiHIV,+in+a+rat,+using+a+quantitative+PCR+method.">Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method.</a> Vaccine. 23, 890-896 (2005).</li><li>Eriksson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+transfer+to+skin+and+wound+by+microseeding.">In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding.</a> J Surg Res. 78, 85-91 (1998).</li><li>Lee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternatively+spliced+IL-15+isoform+modulates+abrasion-induced+keratinocyte+activation.">An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation.</a> J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).</li><li>Rudy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imiquimod+(Aldara):+modifying+the+immune+response.">Imiquimod (Aldara): modifying the immune response.</a> Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).</li><li>van der Fits, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imiquimod-induced+psoriasis-like+skin+inflammation+in+mice+is+mediated+via+the+IL-23/IL-17+axis.">Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis.</a> J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).</li><li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CXCR2+and+BLT1+facilitates+neutrophil+infiltration+and+resultant+keratinocyte+activation+in+a+murine+model+of+imiquimod-induced+psoriasis.">Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis.</a> J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).</li><li>Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+untranslated+region,+signal+peptide,+and+the+coding+sequence+of+the+carboxyl+terminus+of+IL-15+participate+in+its+multifaceted+translational+control.">The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control.</a> J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77, 61-68 (1989).</li><li>Tan, X., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+IL-15+isoforms+generated+by+alternative+splicing+are+expressed+in+the+intestinal+epithelium.">Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium.</a> Genes Immun. 7, 407-416 (2006).</li><li>Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+trafficking+of+DNA+in+keratinocytes:+evidence+for+DNA-binding+proteins.">Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins.</a> Gene Ther. 11, 765-774 (2004).</li><li>Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin.">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li><li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes'+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity.">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li></ol>

De meest kritische stap om de expressie van het plasmide-DNA acufected waarborgen is gelijkmatig oscilleren en draai de hoornlaag van de huid. Terwijl zachtjes duwen de naald zonder dat de huid, moet de kracht hard genoeg om het oppervlak te drukken. Absorptie van DNA in 10 ui oplossing op een 1 cm x 1 cm oppervlak te vergemakkelijken moet de naalden oscilleren op en neer ongeveer 100 keer 30 seconden. Men kan de kracht die moet de huid prikken bepalen en door vaststellend het aantal keren dat nodig is om de beste expre...

Skin is de eerste verdedigingslinie van het lichaam. Keratinocyten (KCS) zijn het belangrijkste celtype in de huid van mensen en muizen. In reactie op prikkels uit de omgeving (bijvoorbeeld zonlicht, zuurstof, chemicaliën en pathogene invasie) worden KCS geactiveerd en produceren een breed scala van pro-inflammatoire cytokines en chemokines zoals IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α en GM-CSF 1. Samen leiden zij de rekrutering van immuuncellen op de huid. Verergerd huidontsteking wordt vaak geassocieerd met talrijke menselijke ziekten, waaronder acute ectopische contact dermatitis en chronische T-cel gemedieerde inflammatie (zoals allergische contact dermatitis en psoriasis) 2. Modulerend pro-inflammatoire reacties in de huid door remming KC activering aannemelijk benadering voor de behandeling van huidontsteking. Dit protocol beschrijft een nieuwe benadering van een cytokine gen in de epidermis transiënte expressie te brengen om immune res bestuderenPonse voortvloeiend uit dergelijke behandeling in de huid. De epidermis componeert de meest oppervlakkige laag van de huid. Het dient als een fysieke barrière houden externe stoffen zoals nucleïnezuren en pathogenen die in de diepere lagen van de huid. Verschillende naaldvrije technieken zijn vastgesteld voor epidermale DNA-overdracht 3, 4. DNA in oplossing of in verband met kationische liposomen of adenovirusvectoren is rechtstreeks op de epidermis gemodificeerd met technieken zoals het verwijderen van het stratum corneum of de behandeling met reagens ontharen. Verwijdering van de verhoornde epitheel vergemakkelijkt DNA die de epidermale barrière en interactie met keratinocyten en Langerhans cellen immuunresponsen 5 induceren. Terwijl een groot oppervlak is beschikbaar voor DNA-overdracht en deze aanpak niet naalden te betrekken, zijn er nadelen, waaronder de eisde grote hoeveelheden DNA (10-100 ug), harde behandeling van de huid door strippen en inconsistente resultaten in het induceren van immunologische respons in de geïmmuniseerde dieren zonder DNA afgifte booster 6. Micropartikels gemedieerde intracellulaire afgifte van naakt DNA aan de huid is getoond zeer efficiënt en reproduceerbaar is voor het induceren immuunreactie 7, 8 zijn. Een draagbare genpistool werd gebruikt om de huid doelwitplaats met plasmide-DNA beklede gouddeeltjes 2 urn diameter in grootte door middel van stromend helium luchtstroom 9 bombarderen. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door KCsand dendritische cellen (DC&#39;s) die in de huid en het eiwit tot expressie lokaal of transport naar drainerende lymfeknopen door DCs 10. Hoewel het gen pistool systeem is eenvoudig en vereist beperkte technische ervaring, de kosten voor de voorbereiding en het leveren van de &quot;DNA bullet &quot;(dat wil zeggen goud poeders, helium gas) en het genenpistool zelf is van algemene toepassing beperkt. Bovendien is de eis van een heliumgas afgiftesysteem beperkt de gemakkelijke gengeweer transport wanneer de proeven op verschillende plaatsen worden uitgevoerd. microzaaien aangetoond is dat een hogere efficiëntie van genoverdracht dan enkele injectie en deeltjesbombardement 11 bereiken. microzaaien gebruikt een tatoegeringskanon om DNA te leveren aan de huid zonder het gebruik van deeltjes kralen 11. Oscillerende de micronaalden op de huid met behulp van deze benadering waarschijnlijk direct schrapen het celmembraan en daardoor overdragen DNA om meerdere cellen tegelijk. echter, pijn bij het grote aantal injecties met 0,254 mm diameter naalden nadeel. Hier geven we een alternatieve benadering van DNA-afgifte in vivo. De &quot;acufection&quot; </strong&gt; protocol we hier beschreven, verschaft een economische en efficiënte manier om plasmide DNA te leveren in de huid van muizen. In het kort, tien acupunctuurnaalden (0,2 mm diameter x 13 mm lang) werden gebonden in een bundel met plakband. Een volume van 10 pi PBS met 10 pg plasmide DNA dat het transgen van interesse werd op het geschoren, ontharingsmiddelen crème behandelde flank huid. Via de acupunctuurnaald bundel over het oppervlak (1 cm x 1 cm) van de huid oscilleren, werden de keratine in de hoornlaag losgemaakt en het plasmide-DNA op het oppervlak werd geabsorbeerd in de epidermis. Beschadiging van de huid werd gecontroleerd en bleek minimaal te zijn. Expressie van het getransfecteerde gen in de acufected huid werd bevestigd door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en ELISA. Het immuunsysteem modulerende effecten van acufection geleverde IL-15ΔE7 op huidontsteking werden aangetoond met behulp van de IMQ behandelde muismodel 12. Terwijl acufection blijkt te zijn een gemakkelijke en minder dema zijnnding werkwijze voor DNA afgifte in vivo, de optimale hoeveelheid DNA voor verschillende genen en de tijd op de huid prikken moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

Ontregeling van de immuunrespons in de huid wordt in verband gebracht met tal van menselijke huid aandoeningen. Rechtstreekse overdracht van immuun-gerelateerde genen in huidweefsel is een fascinerende benadering van immuunmodulatie van cutane ontsteking in muismodellen van ziekten bij de mens te onderzoeken. Hier presenteren we een kosteneffectieve protocol dat naakt DNA in muizenhuid geleverd en leidt tot transgenexpressie. De werkwijze is bedacht &quot;acufection&quot;, duidt acu-lek gemedieerde DNA-trans fection. Acufection te voeren, werd muizenhuid eerst toegediend met DNA in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en daarna licht geprikt met een bundel acupunctuurnaalden om de absorptie van DNA en transfectie in cellen te vergemakkelijken. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door de keratinocyten en dendritische cellen (DC&#39;s) in de huid genomen en expressie gebracht eiwit. Mechanische prik met de naalden op zich niet leiden tot beschadiging van de huid of induceren keratinocyten activering. De uitdrukkingvan de getransfecteerde genen gedetecteerd in de huid zowel transcriptionele en translationele niveaus na acufection gedurende 2 dagen en onderhouden tot 7 dagen. De primaire doelstelling van de ontwikkeling van deze acufection methode was een niet eerder gedefinieerd isovorm van IL-15 te onderzoeken. Met deze werkwijze wordt een alternatief gesplitste IL-15 isovorm met gedeeltelijk verwijderde exon 7 (IL-15ΔE7) werd tot expressie gebracht in de huid en vervolgens behandeld met een Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), ontsteking veroorzaken. -Acufection geleverd IL-15ΔE7 huid onderdrukte proliferatie van keratinocyten, epidermale dikte en rekrutering van neutrofielen in IMQ geïnduceerde huidontsteking. Met de toenemende belangstelling voor het identificeren van de regulerende mechanismen van huidontsteking, het protocol beschreven verschaft een kosteneffectieve en veelzijdig alternatief voor gen kanonsysteem of microzaaien voor DNA afgifte in vivo. Het kan mogelijk maken ontdekking van de functie van een nieuwgen in de huid of voor het onderzoeken van nieuwe behandeling van huidziekten.

Terwijl sommige roodheid was duidelijk binnen het eerste uur na prikken met acupunctuurnaalden, de huid gewist op dag 2 en geen negatieve huidreactie tot dag 7 waargenomen na prikken (figuur 2A). Naald prikken geïnduceerde zeer lage orthokeratosis epidermale en dermale minimale infiltratie door H &amp; E analyse vergeleken met onbehandelde huid (Figuur 2B). De epidermale dikte (figuur 2C) en het aa...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research at JoVE.com

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor expressie van naakt plasmide DNA in muizenhuid. Het algemene doel van het protocol is immuun-gerelateerde genen in huidweefsel aan de functionele rol van een specifiek gen in huidontsteking bakenen.

Ontwikkeling van een Economische DNA Delivery System door &quot;Acufection&quot; en de toepassing ervan op Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

The overall goal of this procedure is to deliver immune related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in a cutaneus inflammation. This method can aid in discovering the function of a novel gene in the skin. For the development of new therapies for cutaneus disease such a psoriasis.The main advantage of this technique is that it provides a cost effective way to express plasmid DNA in mouse skin. To prepare the plasmid DNA inoculate three milliliters of antibiotic supplemented LB medium with the previously transformed and selected bacterial colony. Incubate the culture overnight on a shaker at 37 degrees celsius.After the overnight incubation dilute the bacterial culture in 250 milliliters of LB medium, supplemented with antibiotics to scale-up the culture. Incubate the culture overnight at 37 degrees Celsius with shaking. Use a high-quality endotoxin free plasmid preparation kit to prepare a large quantity of DNA.Dilute the obtained plasmid DNA in sterile PBS to a final concentration of one milligram per milliliter. After anesthetizing the mouse, apply veterinary ophthalmologic ointment to its eyes to prevent dryness. Then shave the skin on the back of the animal.And apply a depilatory cream to dissolve keratin proteins in the remaining hair shafts. Following depilation wipe off the cream with water soaked cotton. Using a sterile cotton swab, soaked in 70%ethanol disinfect the skin surface and mark the target skin area with the previously prepared template Apply 10 microliters of the DNA solution containing 10 micrograms of plasmid DNA to the desired skin area.To acufect the mouse, hold the acupuncture apparatus perpendicularly to the skin and repetitively puncture the designated surface. Either 100 times over 30 seconds or until the solution applied to the skin absorbs. To achieve successful plasmid DNA expression in the skin tissue, it is important avoid cutting deep into the skin and to make sure the DNA solution is well absorbed.After completing the procedure place the acufected mouse on a heating pad to maintain its body temperature until recovery from anesthesia. When the mouse regains sufficient consciousness return it to its cage and provide water and food. Closely monitor the mouse for any symptoms of discomfort including behavioral changes, abnormal appearance for the first 48 hours after the procedure.Mark the flank skin covering the area of two centimeters by two centimeters previously acufected with IL-15deltaE7. Then using a cotton applicator apply Imiquimod cream topically to the designated surface area. To monitor daily changes of the Imiquimod treated dorsal skin, have one researcher record while the second holds the mouse securely and exposes the treated area to the view of the high definition camcorder.Observe for such changes as silvery scale, plaque or erythema on the treated skin. After euthanizing the mouse as described, make a horizontal incision at the base of the tail using a pair of serological scissors and widen the cut bilaterally towards the base of each hind limb. Then proceed with vertical cuts that align with the flanks and reach each base of the four limbs.Carefully peel the skin from the underlying issue starting with the tail towards the head of the animal. Using scissors excise the dorsal skin and transfer the obtained sample to a sterile Petri dish. With a scalpel, excise a suitable sample of the target skin.Then immediately freeze it in liquid nitrogen. To pulverize the skin tissue, place the frozen sample at the center of a previously chilled two compartment tissue pulverizor equipped with handles and a pestle and use a lead hammer on the mortar. Immediately transfer the pulverized tissue into new tubes containing the reagents appropriate for any subsequent analysis.Begin the staining procedure by heating the slides of the formalin fixed paraffin embedded skin sections prepared as detailed in the text protocol, at 65 degrees celsius for 15 minutes. Immerse the slides twice in xylene for five minutes. Then rehydrate the slides through an ethanol gradient.Finally, wash the slides in tap water for three minutes before staining. For Immunohistochemical staining, first draw a circle around the tissue with waterproof pen and then incubate the section with blocking solution to exclude non-specific background staining. After blocking, was the side in PBS.Next pipette the diluted primary antibody onto the section and incubate it for 60 minutes at room temp temperature. Wash the slides thrice in TBST for five minutes. Then overlay one drop of the labeled polymer over the section and incubate the slide at room temperature for 40 minutes.Afterward, wash the slide thrice in TBST for five minutes changing the solution between washes. Then add 100 microliters of DAB solution onto the tissue sections and allow it to react at room temperature. Until a brown product is observed under the microscope.Then wash the slides in water to stop peroxidase activity. Counter stain the section in Methyl Green solution, which specifically binds to DNA for five seconds. Wash the slides three times in PBS for five minutes each.Overlay the stained section with eight microliters of permanent mounting medium and cover it with a cover slip. Finally, image the slides as described in the text protocol. Pictured here is a control mouse and a mouse that was acufected for one hour, two days, five days or seven days prior to when the photograph was taken.As shown here, the acufection procedure did not cause noticeable skin damage. Furthermore, acufection did not influence either skin thickness or the number of Ki67 positive cells. Further confirming that the procedure does not cause tissue disruption or epidermal cell proliferation.The expression of CXCL-1 and IL-6 measured using qRT-PCR. Confirms minimal keratinocyte activation observed under acufection. On the other hand, qRT-PCR and ELISA demonstrated the pronounced expression of IL-15 in the skin of mice acufected with the IL-15 gene.Ultimately, acufection mediated delivery of the IL-15deltaE7 gene to skin tissue prevents the development of flaky skin and neutrophil infiltration Imiquimod treated mice. Once mastered this procedure can be done in 12 minutes if it is performed properly. While attempting this procedure it is important to remember to prepare a new bundle of needles for each acufection ans a batch of high quality plasmid DNA.Following this procedure, other methods like virus infection can be performed in order to answer additional questions like the function of a novel gene in modulating antiviral immune response. After its development this will pave the way for researchers in the field of immunology to explore the immune response in the skin. After watching this video, you should have a good understanding of how to induce the expression of plasmid DNA in the mouse skin in a cost effective manner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Ontwikkeling van een<em&gt; In vitro</em&gt; Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Teelt van<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Een Immunomodulatory Nematode Parasite en haar uitgescheiden producten

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...