Name: development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention du ministère de la Science et de la technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Nous remercions les Drs. Betty Wu-Hsieh et Chien-Kuo Lee à NTU, Leigh Zerboni à l&#39;Université de Stanford et le Dr Peter Hoffmann à l&#39;Université de Hawaii pour lire le manuscrit, Yun Chien à NTU pour l&#39;assistance technique, et le Dr Wen-Chi Wei à la biotechnologie agricole Centre de recherche à l&#39;Academia Sinica pour des conseils techniques.

Des souris femelles à 8 - 12 semaines ont été utilisés pour cette étude. C57 / BL6 de type sauvage (WT) et l&#39; IL-15 déficiente (IL15 - / -) souris ont été achetés auprès de Centre national des animaux de laboratoire (NLAC), Taiwan et Taconic Farm, respectivement. IL-15 déficient (IL15 - / -) et de l&#39; IL-15-dominant (+/- IL15 et l&#39; IL15 + / +) ont montré un rapport 1: 3 dans la deuxième génération de la croix des hétérozygotes de IL15. L...

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	<li>Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cytokines+in+murine+cutaneous+irritant+responses.">Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses.</a> Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nature reviews. 9, 679-691 (2009).</li><li>Liu, L. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+trafficking+of+DNA+in+keratinocytes:+evidence+for+DNA-binding+proteins.">Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins.</a> Gene Ther. 11, 765-774 (2004).</li><li>Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin.">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li><li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes'+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity.">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li></ol>

L&#39;étape la plus critique pour assurer l&#39;expression de l&#39;ADN de plasmide est acufected à osciller de manière uniforme et desserrer la couche cornée de la peau. Tout en poussant les aiguilles doucement sans couper la peau, la force devrait être assez dur pour appuyer sur la surface. Afin de faciliter l&#39;absorption de l&#39;ADN dans une solution de 10 ul sur un 1 cm x surface de 1 cm, les aiguilles doivent osciller vers le haut et vers le bas pour environ 100 fois dans les 30 s. On peut déterminer la f...

La peau est la première ligne de défense de l&#39;hôte. Kératinocvtes (KCS) sont le principal type de cellules dans la peau des humains et des souris. En réponse à des stimuli de l&#39; environnement (par exemple la lumière du soleil, de l&#39; oxygène, les produits chimiques et l&#39; invasion pathogène), KCs sont activés et produisent une grande variété de cytokines et de chimiokines pro - inflammatoires telles que l&#39; IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF - a α et GM-CSF 1. Ensemble, ils déclenchent le recrutement de cellules immunitaires de la peau. Aggravé l&#39; inflammation cutanée est souvent associée à de nombreuses maladies humaines , y compris la dermatite de contact extra - utérine aiguë et l&#39; inflammation T à médiation cellulaire chronique (par exemple la dermatite de contact allergique et le psoriasis) 2. La modulation des réponses pro-inflammatoires dans la peau en inhibant l&#39;activation KC est une approche plausible pour traiter l&#39;inflammation cutanée. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour exprimer transitoirement un gène de cytokine dans l&#39;épiderme afin d&#39;étudier res immunitairesponse en conséquence un tel traitement de la peau. L&#39;épiderme compose la couche la plus superficielle de la peau. Il sert de barrière physique en gardant des substances externes, tels que des acides nucléiques et des agents pathogènes de pénétrer dans les couches profondes de la peau. Plusieurs techniques sans aiguille ont été établies pour le transfert d&#39;ADN de l&#39; épiderme 3, 4. ADN en solution ou associés à des liposomes cationiques ou des vecteurs d&#39;adénovirus a été directement appliqué sur l&#39;épiderme modifiés par des techniques telles que l&#39;élimination de la couche cornée ou le traitement avec un réactif d&#39;épilation. L&#39; élimination de l&#39;épithélium kératinisé facilite l&#39; ADN traversant la barrière épidermique et l&#39; interaction avec les kératinocytes et les cellules de Langerhans pour induire des réponses immunitaires 5. Alors qu&#39;une grande surface est disponible pour le transfert d&#39;ADN et cette approche ne comporte pas d&#39;aiguilles, il y a des inconvénients, y compris l&#39;exigencepour les grandes quantités d&#39;ADN (10 à 100 ug), le traitement dure sur la peau par décapage, et les résultats incohérents dans l&#39; induction d&#39;une réponse immunitaire chez les animaux immunisés sans assistance de délivrance d&#39;ADN 6. L&#39; administration intracellulaire à médiation microparticule d&#39;ADN nu à la peau a été montré très efficace et reproductible pour induire une réponse immunitaire 7, 8. Un canon à gènes tenu à la main a été utilisé pour bombarder le site cible de la peau avec le plasmide particules d&#39;or enrobées d&#39; ADN 2 um de diamètre en taille au moyen d&#39;écoulement d&#39;air de l&#39; hélium sous pression 9. L&#39;ADN plasmidique est probablement absorbé par les cellules dendritiques KCsand (CD) dans la peau et la protéine est exprimée localement ou transporté à ganglions lymphatiques drainants par les CD 10. Bien que le système de canon à gènes est simple et nécessite une expérience technique limitée, le coût pour la préparation et la livraison des &quot;ADN bullaisser &quot;( par exemple des poudres d&#39;or, gaz d&#39;hélium) et pour le canon de gène lui - même a limité son application générale. En outre, l&#39;exigence d&#39;un système de distribution de gaz d&#39;hélium limite la facilité du transport des armes à feu génétique lorsque les expériences sont menées à des endroits différents. Microseeding a été démontrée pour parvenir à une plus grande efficacité de transfert de gène à injection unique et un bombardement de particules 11. Microseeding utilise un pistolet de tatouage pour délivrer l&#39; ADN de la peau sans l&#39;utilisation de perles de particules 11. oscillante microaiguilles sur la peau en utilisant cette approche est susceptible de gratter directement la membrane cellulaire et ainsi transférer l&#39;ADN à plusieurs cellules en même temps. Cependant, la douleur associée au grand nombre d&#39;injections avec des aiguilles 0,254 mm de diamètre est un inconvénient. Nous fournissons ici une approche alternative à la livraison d&#39;ADN in vivo. Le « acufection » </strong&gt; protocole que nous avons décrit ici est un moyen économique et efficace pour fournir l&#39;ADN plasmidique dans la peau de la souris. En bref, dix aiguilles d&#39;acupuncture (0,2 mm de diamètre x 13 mm de longueur) ont été liés dans un faisceau par un ruban adhésif. Un volume de 10 ul de PBS avec 10 pg d&#39;ADN de plasmide contenant le transgène d&#39;intérêt a été placé sur la peau rasée, le flanc traité crème dépilatoire. En utilisant le faisceau d&#39;aiguilles d&#39;acupuncture pour faire osciller la surface (1 cm x 1 cm) de la peau, les kératines dans la couche cornée ont été desserrés et l&#39;ADN plasmidique appliquée à la surface a été absorbé dans l&#39;épiderme. Les lésions cutanées a été surveillée et jugée minime. L&#39;expression du gène transfecté dans la peau acufected a été confirmée à la fois par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et ELISA. Les effets modulateurs immunitaires de l&#39; IL-15ΔE7 rendu de acufection-cutanée sur l&#39; inflammation ont été démontrées en utilisant le modèle de souris traitées IMQ-12. Alors que acufection se révèle être une dema facile et moinsProcédé nding pour la délivrance d&#39;ADN in vivo, la quantité optimale d&#39;ADN de différents gènes et les temps de piquer la peau doivent être soigneusement optimisées pour obtenir des résultats reproductibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

Dysrégulation de la réponse immunitaire dans la peau est associée à de nombreux troubles de la peau humaine. transfert direct de gènes liées au système immunitaire dans les tissus de la peau est une approche fascinante pour étudier la modulation immunitaire de l&#39;inflammation cutanée dans les modèles de souris de maladies humaines. Nous présentons ici un protocole rentable qui a livré l&#39;ADN nu dans la peau de la souris et conduit à l&#39;expression du transgène. Le procédé est inventé « acufection », désignant l&#39; ADN trans fection acu à médiation par la perforation. Pour effectuer acufection, la peau de souris a été perfusée avec de l&#39;ADN dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite piquer légèrement avec un faisceau d&#39;aiguilles d&#39;acupuncture pour faciliter l&#39;absorption de l&#39;ADN et la transfection dans les cellules. L&#39;ADN plasmidique est sans doute repris par le kératinocyte et les cellules dendritiques (CD) dans la peau et exprimé en protéine. Piqûre mécanique avec les aiguilles en tant que tel n&#39;a pas causé de dommages à la peau ou induire l&#39; activation des kératinocytes. L&#39;expressiondes gènes transfectés a été détecté dans la peau à la fois des niveaux transcriptionnels et traductionnels suivants acufection pendant 2 jours et maintenus jusqu&#39;à 7 jours. L&#39;objectif principal pour le développement de cette méthode de acufection était d&#39;étudier une isoforme précédemment définie de l&#39;IL-15. En utilisant cette méthode, une IL-15 isoforme de l&#39;exon 7 (IL-15ΔE7) partiellement supprimé alternativement épissé a été exprimée dans la peau et ensuite traité avec un récepteur de type Toll 7 agoniste (TLR7), imiquimod (IMQ), pour induire une inflammation. IL-15ΔE7 livré Acufection en peau supprimé la prolifération des kératinocytes, l&#39;épaisseur de l&#39;épiderme et le recrutement de neutrophiles dans l&#39;inflammation cutanée induite par IMQ. Avec l&#39;intérêt croissant pour identifier les mécanismes de régulation de l&#39; inflammation cutanée, le protocole décrit ici fournit une alternative rentable et polyvalent pour le système de canon à gènes ou microseeding pour la délivrance d&#39;ADN in vivo. Il peut potentiellement permettre la découverte de la fonction d&#39;un romangène dans la peau ou pour enquêter sur un nouveau traitement pour les maladies cutanées.

Alors que quelques rougeurs était évidente dans la première heure après avec des aiguilles d&#39; une piqûre acupuncture, la peau éclaircit le jour 2 et aucune réaction cutanée indésirable jusqu&#39;au jour 7 a été observée après repiquage (figure 2A). Picotement de l&#39; aiguille induit très faible niveau de orthokératosiques épidermique et infiltration cutanée minimale par l&#39; analyse H &amp; E par rapport à la peau non traitée <stro...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Ce protocole est une alternative rentable pour exprimer l&#39;ADN plasmidique nu dans la peau de la souris. L&#39;objectif général du protocole est de délivrer des gènes liées au système immunitaire dans le tissu de la peau pour délimiter le rôle fonctionnel d&#39;un gène spécifique dans l&#39;inflammation cutanée.

Développement d&#39;un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

The overall goal of this procedure is to deliver immune related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in a cutaneus inflammation. This method can aid in discovering the function of a novel gene in the skin. For the development of new therapies for cutaneus disease such a psoriasis.The main advantage of this technique is that it provides a cost effective way to express plasmid DNA in mouse skin. To prepare the plasmid DNA inoculate three milliliters of antibiotic supplemented LB medium with the previously transformed and selected bacterial colony. Incubate the culture overnight on a shaker at 37 degrees celsius.After the overnight incubation dilute the bacterial culture in 250 milliliters of LB medium, supplemented with antibiotics to scale-up the culture. Incubate the culture overnight at 37 degrees Celsius with shaking. Use a high-quality endotoxin free plasmid preparation kit to prepare a large quantity of DNA.Dilute the obtained plasmid DNA in sterile PBS to a final concentration of one milligram per milliliter. After anesthetizing the mouse, apply veterinary ophthalmologic ointment to its eyes to prevent dryness. Then shave the skin on the back of the animal.And apply a depilatory cream to dissolve keratin proteins in the remaining hair shafts. Following depilation wipe off the cream with water soaked cotton. Using a sterile cotton swab, soaked in 70%ethanol disinfect the skin surface and mark the target skin area with the previously prepared template Apply 10 microliters of the DNA solution containing 10 micrograms of plasmid DNA to the desired skin area.To acufect the mouse, hold the acupuncture apparatus perpendicularly to the skin and repetitively puncture the designated surface. Either 100 times over 30 seconds or until the solution applied to the skin absorbs. To achieve successful plasmid DNA expression in the skin tissue, it is important avoid cutting deep into the skin and to make sure the DNA solution is well absorbed.After completing the procedure place the acufected mouse on a heating pad to maintain its body temperature until recovery from anesthesia. When the mouse regains sufficient consciousness return it to its cage and provide water and food. Closely monitor the mouse for any symptoms of discomfort including behavioral changes, abnormal appearance for the first 48 hours after the procedure.Mark the flank skin covering the area of two centimeters by two centimeters previously acufected with IL-15deltaE7. Then using a cotton applicator apply Imiquimod cream topically to the designated surface area. To monitor daily changes of the Imiquimod treated dorsal skin, have one researcher record while the second holds the mouse securely and exposes the treated area to the view of the high definition camcorder.Observe for such changes as silvery scale, plaque or erythema on the treated skin. After euthanizing the mouse as described, make a horizontal incision at the base of the tail using a pair of serological scissors and widen the cut bilaterally towards the base of each hind limb. Then proceed with vertical cuts that align with the flanks and reach each base of the four limbs.Carefully peel the skin from the underlying issue starting with the tail towards the head of the animal. Using scissors excise the dorsal skin and transfer the obtained sample to a sterile Petri dish. With a scalpel, excise a suitable sample of the target skin.Then immediately freeze it in liquid nitrogen. To pulverize the skin tissue, place the frozen sample at the center of a previously chilled two compartment tissue pulverizor equipped with handles and a pestle and use a lead hammer on the mortar. Immediately transfer the pulverized tissue into new tubes containing the reagents appropriate for any subsequent analysis.Begin the staining procedure by heating the slides of the formalin fixed paraffin embedded skin sections prepared as detailed in the text protocol, at 65 degrees celsius for 15 minutes. Immerse the slides twice in xylene for five minutes. Then rehydrate the slides through an ethanol gradient.Finally, wash the slides in tap water for three minutes before staining. For Immunohistochemical staining, first draw a circle around the tissue with waterproof pen and then incubate the section with blocking solution to exclude non-specific background staining. After blocking, was the side in PBS.Next pipette the diluted primary antibody onto the section and incubate it for 60 minutes at room temp temperature. Wash the slides thrice in TBST for five minutes. Then overlay one drop of the labeled polymer over the section and incubate the slide at room temperature for 40 minutes.Afterward, wash the slide thrice in TBST for five minutes changing the solution between washes. Then add 100 microliters of DAB solution onto the tissue sections and allow it to react at room temperature. Until a brown product is observed under the microscope.Then wash the slides in water to stop peroxidase activity. Counter stain the section in Methyl Green solution, which specifically binds to DNA for five seconds. Wash the slides three times in PBS for five minutes each.Overlay the stained section with eight microliters of permanent mounting medium and cover it with a cover slip. Finally, image the slides as described in the text protocol. Pictured here is a control mouse and a mouse that was acufected for one hour, two days, five days or seven days prior to when the photograph was taken.As shown here, the acufection procedure did not cause noticeable skin damage. Furthermore, acufection did not influence either skin thickness or the number of Ki67 positive cells. Further confirming that the procedure does not cause tissue disruption or epidermal cell proliferation.The expression of CXCL-1 and IL-6 measured using qRT-PCR. Confirms minimal keratinocyte activation observed under acufection. On the other hand, qRT-PCR and ELISA demonstrated the pronounced expression of IL-15 in the skin of mice acufected with the IL-15 gene.Ultimately, acufection mediated delivery of the IL-15deltaE7 gene to skin tissue prevents the development of flaky skin and neutrophil infiltration Imiquimod treated mice. Once mastered this procedure can be done in 12 minutes if it is performed properly. While attempting this procedure it is important to remember to prepare a new bundle of needles for each acufection ans a batch of high quality plasmid DNA.Following this procedure, other methods like virus infection can be performed in order to answer additional questions like the function of a novel gene in modulating antiviral immune response. After its development this will pave the way for researchers in the field of immunology to explore the immune response in the skin. After watching this video, you should have a good understanding of how to induce the expression of plasmid DNA in the mouse skin in a cost effective manner.

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