Name: development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione da parte del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Ringraziamo Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee al NTU, Leigh Zerboni presso la Stanford University e il dottor Peter Hoffmann presso l&#39;Università delle Hawaii per la lettura del manoscritto, Yun Chien a NTU per l&#39;assistenza tecnica, e il dottor Wen Wei-Chi in agricoltura biotecnologie Centro di ricerca presso Academia Sinica per un parere tecnico.

topi femmina a 8 - 12 settimane di età sono stati utilizzati per questo studio. C57 / BL6 wild-type (WT) e IL-15 carente (IL15 - / -) topi sono stati acquistati da National Laboratory Animal Centre (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, rispettivamente. IL-15-deficienti (IL15 - / -) e IL-15-dominante (IL15 +/- e IL15 + / +) hanno mostrato un rapporto 1: 3 nella seconda generazione dalla croce di eterozigoti IL15 +/-. Il genotipo di IL-15 - / - mice è stata confe...

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	<li>Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cytokines+in+murine+cutaneous+irritant+responses.">Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses.</a> Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nature reviews. 9, 679-691 (2009).</li><li>Liu, L. 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La fase più critica per garantire l&#39;espressione del DNA plasmidico è acufected ad oscillare in modo uniforme e allentare lo strato corneo della pelle. Spingendo gli aghi delicatamente senza tagliare la pelle, la forza dovrebbe essere abbastanza duro per deprimere la superficie. Per facilitare l&#39;assorbimento del DNA in 10 microlitri soluzione su un 1 cm x 1 cm di superficie, gli aghi devono oscillare su e giù per circa 100 volte in 30 s. Si può determinare la forza che deve pungere la pelle e notando il numer...

La pelle è la prima linea di difesa ospite. Cheratinociti (KC) sono il tipo di cellula importante nella pelle degli esseri umani e topi. In risposta a stimoli ambientali (per esempio luce solare, ossigeno, prodotti chimici e invasione patogeni), KC sono attivati e produrre una vasta gamma di citochine proinfiammatorie e chemochine, quali IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α e GM-CSF 1. Insieme innescano il reclutamento di cellule immunitarie per la pelle. Infiammazione cutanea aggravata è spesso associata a numerose malattie umane compresi dermatite da contatto ectopica acuta e l&#39;infiammazione mediata da cellule T cronica (es dermatite allergica da contatto e psoriasi) 2. Modulando risposte proinfiammatorie nella pelle inibendo l&#39;attivazione KC è un approccio plausibile per trattare l&#39;infiammazione cutanea. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per esprimere transitoriamente un gene citochina nell&#39;epidermide per studiare res immunitarioponse conseguenti ad un tale trattamento nella pelle. L&#39;epidermide compone lo strato più superficiale della pelle. Essa funge da barriera fisica mantenendo sostanze esterne come acidi nucleici e patogeni di entrare negli strati più profondi della pelle. Diverse tecniche senza ago sono stati stabiliti per il trasferimento epidermica DNA 3, 4. DNA in soluzione o associata con liposomi cationici o vettori di adenovirus è stata applicata direttamente alla epidermide modificati con tecniche come la rimozione dello strato corneo o il trattamento con il reagente depilazione. Rimozione dell&#39;epitelio corneo facilita DNA attraversare la barriera epidermica e l&#39;interazione con cheratinociti e cellule di Langerhans per indurre risposte immunitarie 5. Mentre una grande area di superficie disponibile per il trasferimento di DNA e questo approccio non comporta aghi, ci sono svantaggi tra cui il requisitoper le grandi quantità di DNA periodo (10 - 100 pg), trattamento duro sulla pelle di strippaggio, ei risultati inconsistenti nell&#39;indurre risposta immunitaria negli animali immunizzati senza consegna DNA richiamo 6. Consegna intracellulare microparticelle mediata da DNA nudo alla pelle ha dimostrato di essere altamente efficiente e riproducibile per indurre la risposta immunitaria 7, 8. Una pistola gene portatile è stato utilizzato per bombardare sito bersaglio pelle con plasmide particelle d&#39;oro rivestite di DNA 2 micron di diametro di dimensioni per mezzo del flusso d&#39;aria in pressione dell&#39;elio 9. Il DNA plasmidico è presumibilmente assorbito dalle cellule dendritiche (DC) KCsand nella pelle e la proteina è espressa localmente o essere trasportati a linfonodi drenanti dalle DC 10. Anche se il sistema di pistola gene è semplice e non richiede esperienza tecnica limitata, il costo per la preparazione e la consegna dei &quot;bul DNAlet &quot;(cioè polvere d&#39;oro, gas elio) e per la pistola gene stesso ha limitato l&#39;applicazione generale. Inoltre, la necessità di un sistema di erogazione di gas elio limita la facilità di trasporto pistola genica quando gli esperimenti sono condotti in luoghi diversi. Microseeding è stato dimostrato per ottenere una maggiore efficienza del trasferimento genico di singola iniezione e bombardamento di particelle 11. Microseeding utilizza una pistola tatuaggio per consegnare il DNA alla pelle senza l&#39;uso di perline di particelle 11. oscillante i microaghi sulla pelle utilizzando questo approccio rischia di raschiare direttamente la membrana cellulare e quindi trasferire il DNA a più celle contemporaneamente. Tuttavia, il dolore associato con il gran numero di iniezioni con aghi 0,254 mm di diametro è uno svantaggio. Qui forniamo un approccio alternativo alla consegna del DNA in vivo. Il &quot;acufection&quot; </strong&gt; protocollo abbiamo descritto qui fornisce un modo economico ed efficiente per fornire DNA plasmidico in pelle topo. Brevemente, dieci aghi (0,2 mm di diametro x 13 mm di lunghezza) sono stati legati in un fascio con nastro adesivo. Un volume di 10 microlitri di PBS con 10 pg di DNA plasmide contenente il transgene di interesse è stato posto sulla rasata, depilatoria pelle fianco crema-trattata. Utilizzando il fascio di agopuntura oscillare la superficie (1 cm x 1 cm) della pelle, le cheratine a strato corneo sono stati allentati e il DNA plasmidico applicato alla superficie è stato assorbito nell&#39;epidermide. danni alla pelle è stata monitorata ed è risultato essere il minimo. Espressione del gene trasfettato nella pelle acufected stato confermato sia quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) ed ELISA. Gli effetti modulatori del sistema immunitario del acufection consegnate IL-15ΔE7 su infiammazione cutanea sono stati dimostrati utilizzando il modello di topo IMQ-trattati 12. Mentre acufection dimostra di essere un dema facile e menoMetodo nding per la consegna del DNA in vivo, la quantità ottimale di DNA per i diversi geni e le volte per pungere la pelle deve essere attentamente ottimizzata per ottenere risultati riproducibili.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

Disregolazione della risposta immunitaria in pelle è associata a numerosi disturbi della pelle umana. Trasferimento diretto dei geni immuno-correlati nel tessuto della pelle è un approccio interessante per indagare la modulazione immunitaria di infiammazione cutanea in modelli murini di malattie umane. Qui vi presentiamo un protocollo costo-efficacia che ha trasportato DNA nudo in pelle mouse e porta alla espressione del transgene. Il metodo è coniato &quot;acufection&quot;, che denota acu DNA puntura mediata fection trans. Per eseguire acufection, pelle di topo è stato infuso con il DNA in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi punge leggermente con un fascio di aghi per favorire l&#39;assorbimento di DNA e trasfezione in cellule. Il DNA plasmidico è presumibilmente occupato da cheratinociti e cellule dendritiche (DC) nella pelle ed espresso in proteine. Puntura meccanico con il aghi per sé non ha causato danni alla pelle o indurre attivazione dei cheratinociti. L&#39;espressionedei geni trasfettati è stato rilevato nella pelle sia a livello trascrizionale e traslazionale seguenti acufection per 2 giorni e mantenuto fino a 7 giorni. L&#39;obiettivo primario per lo sviluppo di questo metodo acufection è stato quello di indagare su un&#39;isoforma precedenza indefinito di IL-15. Usando questo metodo, un splicing alternativo IL-15 isoforma con parzialmente eliminato esone 7 (IL-15ΔE7) è stata espressa nella pelle e successivamente trattati con un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), per indurre infiammazione. Acufection consegnate IL-15ΔE7 in pelle soppressa proliferazione dei cheratinociti, spessore epidermico e il reclutamento di neutrofili nell&#39;infiammazione cutanea IMQ-indotta. Con crescente interesse nell&#39;identificazione dei meccanismi regolatori di infiammazione cutanea, il protocollo qui descritto fornisce un costo alternativo efficace e versatile al cannone gene o microseeding per la consegna del DNA in vivo. Essa può consentire potenzialmente scoperta della funzione di un romanzogene in pelle o per indagare nuovo trattamento per le malattie cutanee.

Mentre alcuni rossore era evidente entro la prima ora dopo puntura con aghi di agopuntura, la pelle liberata il giorno 2 ed è stata osservata alcuna reazione avversa cutanea fino al giorno 7 dopo puntura (Figura 2A). Ago che pungono indotto molto basso livello di epidermico orthokeratosis e infiltrazione dermica minima da H &amp; E analisi comparata con la pelle non trattata (Figura 2B). Lo spessore epidermico <strong class="xf...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Questo protocollo è un&#39;alternativa economica per esprimere il DNA plasmidico nudo in pelle topo. L&#39;obiettivo generale del protocollo è quello di consegnare i geni immuno-correlati nel tessuto della pelle di delineare il ruolo funzionale di un gene specifico in infiammazione cutanea.

Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da &quot;Acufection&quot; e la sua applicazione alla ricerca della pelle

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

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