Name: functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish
Uploaded: 2017-04-22T13:00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish at JoVE.com

We willen de leden van de Pelegri lab en vis faciliteit leidinggevend personeel, die instrumenteel in dit project te vergemakkelijken waren bedanken. De steun voor dit project werd verstrekt door NIH R56 GM065303 en NIH 2 T32 GM007133 tot ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 en NIH 2 T32 GM007133 tot CCE, en NIH RO1 GM065303 FP

Alle zebravis werden behandeld in strikte overeenstemming met goede dierenpraktijk, zoals gedefinieerd door de relevante nationale en / of lokale dierenwelzijn lichamen, en alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de bevoegde commissie (University of Wisconsin-Madison assurance nummer A3368-01). De dieren werden onder standaard omstandigheden bij 26,5 ° C gehouden. 1. Pre-selectie van de vrouwen LET OP: Eicellen in volwassen vrouwtjes meestal span een reeks ontwikkelingsstadia, van fase I tot en met V (figuur 2). Het zuiveren van de vrouwtjes van reeds bestaande eicellen door middel van een succesvolle natuurlijke dekking verhoogt de synchronisatie van eicel enscenering, als nieuw te ontwikkelen eicellen verschijnen als een cohort 3, 14. Binnen ongeveer 8 dagen na de zuivering, de meeste eicellen in een vroeg stadium IV, die optimaal is voor het initiëren van in vitro rijping. Dergelijke synchronisatie verhoogt de opbrengst aan oöcyten that kan gaan door het volledige proces van in vitro rijping experimentele manipulatie vergemakkelijkt. Zie eerdere beschrijvingen 13 voor details over het instellen van vis in gepaarde paringen en vis watersamenstelling (hier 14 g oceaan zout en 150 g NaHCO3 per 1000 liter omgekeerde osmose, pH 6.5-8.5 (voorkeurstraject: 6.8 -7,5) en een geleidbaarheid van 180-360 uS). Zie Brand et al. 13 voor aanvullende recepten. <ol><li> Acht tot tien dagen voor de in vitro cultuur manipulatie, gebruik dan een visnet tot één mannelijke en één vrouwelijke vis van de gewenste spanning over te dragen aan een paring tank. Pair meerdere sets. Laat ze in de paring tank &#39;s nachts. Laat ze om te paren tijdens de avond en door de middag van de volgende dag. </li><li> Gebruik een vis net om de vrouwtjes die eieren leveren tijdens het paren en plaats ze in een aparte tank te scheiden. Feed deze vrouwtjes twee keer per dag met een voedselallergie mengsel containing ongeveer evenveel artemia en visvoer vlokken. De hoeveelheid voedsel moet voldoende zijn om ongeveer 20 minuten, maar niet meer van voedertijd verschaffen. </li></ol> 2. Bereiding van rijpingmedium OPMERKING: Bereid volgroeiingsmedium op de dag van de in vitro rijping experiment, binnen 1 uur van het verwijderen van de oöcyten van vrouwelijke (zie sectie 3). <ol><li> Voeg 20 ml Leibovitz L-15 medium met L- glutamine, pH 7,0, met een 50 ml conische buis onder steriele omstandigheden. Breng het op pH 9,0 met 10 N NaOH. </li><li> Voeg 9 ml Leibovitz L-15 medium, pH 9,0, met 2 afzonderlijke 50 ml conische buizen. Label 1 tube &quot;+ DHP&quot; en ander &quot;-DHP.&quot; </li><li> In de + DHP buis, voeg 10 ul van 17α-20β-dihydroxy-4-pregneen 3-on (DHP), 490 pl dH 2 O en 500 pl 10% runderserumalbumine (BSA). </li><li> In de -DHP buis, voeg 100 ul van 10 mg / ml gentamycine, 40081, l dH 2 O en 500 pl 10% BSA. </li></ol> 3. Ontleding van de Eicellen en initiatie van de in vitro cultuur NB: De in vitro kweek experiment wordt uitgevoerd met vooraf geselecteerde vrouwtjes 8-10 dagen nadat ze vrijkomen eieren door middel van natuurlijke paring uitgevoerd. Gebruik rijping medium maakte op dezelfde dag (zie hoofdstuk 2). Eicellen rijpen op de juiste wijze als de dissectie is begonnen in de buurt van het einde van de vis dagelijkse gang (in het laboratorium bepaald door vooraf ingestelde kunstlicht in de vis faciliteit) 13, mogelijk nabootsen van processen die zich door middel van natuurlijke dekking. Dit houdt in dat de meeste stappen in het protocol in de avond moeten worden uitgevoerd als vissen worden gehuisvest in een faciliteit met een standaard licht cyclus (bijvoorbeeld beginnend stap 3.2 om 6 uur in een faciliteit met een 08:00-10:00 licht periode), hoewel andere werkzaamheden tijdsperioden mogelijk een geschikte tijd verschoven lichtcyclus. <ol><li> Bereid een 0,2% tricaïne voorraadoplossing in dH 2 O, gebufferd tot pH 7,0 met 1 M Tris, pH 9,0, en houd deze oplossing bij 4 ° C. Dit kan van tevoren worden voorbereid. </li><li> Start de proef 0-4 uur voor het einde van de dagelijkse lichtcyclus in de faciliteit. In een 250 ml bekerglas, voeg 20 ml 0,2% tricaïne voorraadoplossing, pH 7,0, 80 ml water en meng vis. </li><li> Breng de vooraf geselecteerde vrouwtjes tricaïne oplossing en euthanaseren hen door overbelichting. Laat de vrouwen in de tricaïne gedurende 15 minuten na de beëindiging van kieuw beweging. </li><li> Met behulp van een lepel, het verzamelen van de geëuthanaseerd vis uit de tricaïne oplossing en spoel ze kort in vis water. Leg de vis op een papieren handdoek om het overtollige water op te vangen. </li><li> Gebruik een schoon scheermesje om de euthanized vissen onthoofden ter hoogte van de borstvin. Gebruik ontleden schaar Maak een longitudinale incisie aan de ventrale zijde van de vissen, die zich vanaf het voorste einde naar het anale gebied. </li><li&gt; Leg de vis op een petrischaal onder een dissectie microscoop met invallend licht. Behulp van een paar ontleden tang, transfer ovarium porties een 35 x 10 mm kweekschaal met 4 ml Leibovitz L-15 medium + DHP. OPMERKING: De eierstokken, waarin ontwikkelingslanden eicellen bevatten, wordt weergegeven als ondoorzichtig en klonterig structuren binnen de interne lichaamsholte. </li><li> Gebruik ontleden pincet voorzichtig dissociëren de eicellen uit de folliculaire massa. Sorteren vroeg stadium IV eicellen (Figuur 2B, vóór GV afbraak, met nagenoeg maximale grootte en gekenmerkt door een donkere, opake cytoplasma en duidelijker GV asymmetrisch gelegen binnen de eicel). Gooi oöcyten eerdere fasen (figuur 2A) en doorschijnend, volwassen stadium V eieren (vergelijkbaar met die in figuur 2C, maar in de eierstokken vóór DHP behandeling). OPMERKING: Eicellen worden geselecteerd voor rijping in vroeg stadium IV, het vroegste stadium dat resulteert in volwassen, stadium V oocytes na in vitro kweekomstandigheden (figuur 2C en D) 3. Omdat stadium IV oöcyten actief produceren producten, manipuleren in deze fase maakt de expressie van exogene RNA producten via injectie of voor de vermindering van genfunctie via ingebracht MO. </li><li> Gebruik een glazen Pasteur pipet het vroege stadium IV eicellen te dragen aan een tweede 35 x 10 mm plastic kweekschaal met 4 ml Leibovitz L-15 medium + DHP. Overdracht minimale hoeveelheden -DHP medium om de schotel met de + DHP oplossing. </li></ol> 4. Oocyte Microinjecties OPMERKING: Geïsoleerde stadium IV oöcyten ondergaan in vitro rijping kan micro-injectie reagentia te manipuleren of functionele gemerkte eiwit expressie brengen. De micro-injectie van reagentia, zoals mRNA en MO (zie hoofdstuk 4) wordt gewoonlijk uitgevoerd wanneer de oöcyten ondergaan in vitro maturantsoen in + DHP medium vóór defolliculation. Indien gewenst, om meer tijd voor manipulaties uit te voeren oöcytmaturatie mogelijk, de injecties kan ook worden uitgevoerd in -DHP medium, vóór rijping gedurende ten minste 2 uur. Ze kunnen echter worden overgedragen aan + DHP medium. <ol><li> MRNA bereid met een standaard expressiekit. Bewaar ze bij -80 ° C als 100-500 pg / pl voorraad voor injectie bij een uiteindelijke concentratie van 50-500 pg / pl (200 pg / pl aanbevolen) in RNA-kwaliteit water. MO bereiden met een concentratie van 4 ng / ul in water volgens de instructies van de fabrikant. Injecteer die in eindconcentraties van 2 ng / ul (of zoals empirisch bepaald). OPMERKING: Injecties worden doorgaans uitgevoerd in + DHP milieu uitgevoerd voorafgaand aan defolliculation (zie de opmerking in hoofdstuk 5). </li><li> Indien injecteren mRNA, onmiddellijk voorafgaand aan de injectie Verdun het mRNA met behulp van RNA-grade omgekeerde osmose en 0,2 M KCl tot een uiteindelijke oplossing van 0,1 M KCl bereiken.</li><li> Als een injectie MO, onmiddellijk voorafgaand aan de injectie verdunnen MO tot de gewenste concentratie met behulp omgekeerde osmose en 0,2 M KCl tot een uiteindelijke oplossing van 0,1 M KCl bereiken. </li><li> Vast zetten oöcyten met fijne pincet en injecteer ongeveer 1 nL in wild-type trap IV oöcyten behulp van een naald die met een getrokken glazen capillaire pipet. <ol><li> Bereid de glazen naalden door te trekken verwarmde glazen capillairen, het laden van de oplossing te injecteren, en het breken van de naaldpunt met een tang, zoals eerder beschreven protocollen voor standaard injectie in zebravis embryo vroege 15. Opmerking: Het is handig als de naald een geleidelijke tapsheid plaats van een abrupte on; dit zorgt voor meer flexibiliteit in termen van de locatie van de breuk in de naaldtip en helpt om schade aan de geïnjecteerde embryo ook voorkomen. Gebruik van dezelfde naald en oplossing voor het embryo injecties, pas het geïnjecteerde volume door vooraf bepalen van demicroinjectie drukinstellingen het gewenste volume te produceren. Deze instellingen kunnen worden bepaald met mock-injecteren in een druppel minerale olie op een microscooptafel kalibratie schuif (0,01 mm) en het aanpassen van de microinjector instellingen naar de gewenste diameter in het geïnjecteerde bolus te verkrijgen, zoals hiervoor beschreven 15. </li></ol></li></ol> 5. oöcytmaturatie en Defolliculation LET OP: Tijdens eicelrijping zal de eicellen geleidelijk doorzichtig geworden, die het mogelijk maakt voor de beoordeling van succesvolle kweekomstandigheden. <ol><li> Verder het incuberen van de onrijpe (en eventueel geïnjecteerd) oöcyten in + DHP medium bij 26,5 ° C, controle periodiek (elke 30 minuten) zodat de eicellen intact blijven en correcte rijping ondergaan door zich geleidelijk doorzichtig (zie figuur 2C) . <ol><li> Verwijder eventuele lyseren eicellen met een Pasteur pipet en gooi ze wegin een laboratorium afval beker om de kwaliteit van het medium te handhaven. Wisselen het kweekmedium met ongeveer een half volume vers medium + DHP om een ​​heldere oplossing te houden, afhankelijk van de hoeveelheid lysis eicel. </li><li> Kan de in vitro rijping verlopen tot de meerderheid van de eicellen doorzichtig te worden en een GV die niet meer duidelijk (ongeveer 2 uur in DHP behandeling, zie Figuur 2C in vergelijking met D). Bekijk ze onder een dissectie microscoop met doorgelaten licht optiek. </li></ol></li><li> Verwijder het buitenste membraan van folliculaire elke gerijpte eicel. Met extra fijne tang om een ​​scheur in de folliculaire membraan te maken in een regio met meer ruimte tussen de eicel en het membraan. Afpellen van een deel van het membraan en rol de eicel uit het membraan te drukken terwijl de gepelde deel. LET OP: Het onderliggende chorionic membraan zal blijven typisch in nauwe samenwerking met het ei tijdens dit proces; na ei activation, expandeert om een ​​beschermende laag voor het embryo te vormen. </li><li> Breng de defolliculated eicellen in een minimaal volume van medium (typisch, transfer ongeveer 5-10 rijpe eicellen in minder dan 20 pi) naar een petrischaal met een paar druppels van de cultuur (+ DHP) medium en overgaan tot bevruchting. </li></ol> 6. Bevruchting van in vitro geteelde eicellen Opmerking: Het sperma oplossing op ijs onder bereid, zal het vermogen behouden gedurende ongeveer 2 uur. <ol><li> Bereid een oplossing zaadcel het einde van de oöcytrijping stap en vóór gebruik testes defolliculation vijf mannen in 500 pl Hank&#39;s oplossing, zoals eerder 16, 17 beschreven. </li><li> Voeg 10-50 ul van sperma oplossing voor het defolliculated eicellen in + DHP kweekmedium. Wacht 10 seconden. </li><li> Met behulp van een pipet, voeg een paar druppels van embryonale (E3) medium om de eicellen. Wacht 1 minuut en vervolgens overstroming van de plat met E3 medium. OPMERKING: De samenstelling van E3 medium is als volgt: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 en 1-5% methyleenblauw 13. </li><li> Herhaal stap 5.3, 6.2 en 6.3 om grotere aantallen van bevruchte embryo&#39;s te verkrijgen. </li><li> Laat de bevruchte embryo&#39;s te ontwikkelen. Gebruik een dissectie microscoop met doorvallend licht optiek om de voortgang te observeren door de splitsing fasen succesvolle bevruchting te waarborgen, zoals eerder beschreven voor bevruchting 17 en 18 opvoeren. </li></ol>

<ol>
	<li>Lindeman, R., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+maternal-effect+genes:+insights+into+fertilization,+early+cleavage+divisions,+and+germ+cell+determinant+localization+from+studies+in+the+zebrafish.">Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish.</a> Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).</li><li>Abrams, E. W., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+development:+it's+in+the+maternal+genes.">Early zebrafish development: it's in the maternal genes.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).</li><li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes.">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).</li><li>Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+for+oocyte+maturation+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).</li><li>Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+assessment+of+overripening+in+turbot+(Scophtalmus+maximus)+by+a+simple+pH+measurement.">Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement.</a> Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).</li><li>Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+ovarian+fluid+in+4+salmonid+speices:+Onchorhynchus+mykiss,+Salmo+trutta+flacustris,+Salvelinus+alpinus+and+Husho+hucho.">Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho.</a> Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).</li><li>Pati&#241;o, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+pH+on+hormonally+regulated+ovarian+follicle+maturation+and+ovulation+in+Atlantic+croaker.">Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker.</a> Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).</li><li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes.">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).</li><li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine/paracrine+control+of+zebrafish+ovarian+development.">Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development.</a> Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).</li><li>Kane, D. A., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+midblastula+transition.">The zebrafish midblastula transition.</a> Development. 119 (2), 447-456 (1993).</li><li>Kanagaraj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Souffle/Spastizin+controls+secretory+vesicle+maturation+during+zebrafish+oogenesis.">Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+oocyte+growth+and+vitellogenin+gene+expression+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).</li><li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment.">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+zebrafish.">Stages of embryonic development in the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+with+the+old,+in+with+the+new:+reassessing+morpholino+knockdowns+in+light+of+genome+editing+technology.">Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology.</a> Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).</li><li>Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 135, (2016).</li><li>Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+products+of+futile+cycle/lrmp+promote+centrosome-nucleus+attachment+in+the+zebrafish+zygote.">Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote.</a> Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).</li><li>Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosomal+passenger+protein+Birc5b+organizes+microfilaments+and+germ+plasm+in+the+zebrafish+embryo.">The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo.</a> PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).</li><li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aura+(mid1ip1l)+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition.">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Bovenstaand protocol is voor het manipuleren van genproducten voor de bevruchting, waardoor voor de studie van moederlijke genproducten in de vroege zebravisembryo. Eerdere studies hebben kunnen eicellen rijpen in vitro 4 geweest; Dit protocol werd gewijzigd om de daaropvolgende bevruchting in vitro gerijpte oöcyten 8. Hierdoor maakt de injectie van reagentia voor functionele manipulatie en visualisatie van maternaal overgeërfd producten in het vroege embryo 3. Embryo&#39;s die voortvloeien uit deze methode kan levensvatbaar zijn en kunnen overleven vruchtbare volwassenen. In voorlopige experimenten, ongeveer de helft van de bevruchte embryo&#39;s zijn afgeleid van deze procedure waren levensvatbaar op dag 5 van de ontwikkeling, zoals vastgesteld door de blaas inflatie zwemmen in dat stadium, waarvan ongeveer de helft werd gezond, vruchtbaar volwassenen (niet gepubliceerde waarnemingen). Er zijn een aantalkritische stappen te overwegen in het protocol. Eicellen na te gaan en rijping (vroeg stadium IV) leiden kan worden verrijkt wanneer het vrouwtje is onlangs gedekt, maar niet voordat 8 dpp. Het gebruik van vis die niet onlangs hebben gepaard zou kunnen leiden tot het degenereren eieren 14, die niet rijping zal ondergaan. Vrouwtjes gedekt binnen minder dan 8 dagen zal een meerderheid van eieren in stadium III of lager, en dus zal de eieren niet goed rijpen in vitro. Eierstokken bij vrouwen die 8 dagen voor gepaard zal een optimale fractie van eicellen in een vroeg stadium IV hebben. Deze zijn te herkennen aan de dichtheid en de aanwezigheid van de GV in een excentrische positie (figuur 2B). Oöcyt fase bepaling kan ook worden geholpen door groottemeting, de oöcyten op een gegradueerde micrometerverdeling onder een microscoop gelegd en vergeleken met standaard richtlijnen staging (tabel 1). Echter, vroeg stadium IV eicellen hebben bijna maximale omvang ten opzichte van volwasseneicellen (herkend door hun relatieve transparantie en het ontbreken van een GV Figuur 2C) en zijn gemakkelijk te herkennen, zoals hierboven beschreven, die in het algemeen neemt de noodzaak van een directe maat opmeten eicel. In vitro rijping moet beginnen binnen enkele uren na het einde van het daglicht cyclus waarop de vrouwelijke eiceldonoren zijn aangepast. Eicellen niet goed rijpen, uiting in de lage bemesting tarieven, indien gekweekt tijdens de ochtend periode van het licht cyclus. De reden voor het circadiane afhankelijkheid van de in vitro rijping van oöcyten werkwijze is niet duidelijk, maar waarschijnlijk weerspiegelt onderliggende circadiane vertekening bij in vivo rijping van eicellen waarbij een cyclus genexpressie tijdens oögenese 21. Een gemeenschappelijke oorzaak van oöcyten niet succesvol in vitro rijping ondergaan ondanks goede eicel staging is dat de DHP verlopen. DHP hormoon verloopt over het algemeen na een jaar, en om effect te verzekerenive rijping, moet de werkende batch worden vervangen binnen 9 maanden van gebruik. Het injecteren van oöcyten is een belangrijke stap bij het doel van de werkwijze is de functionele manipulatie van maternale producten. Deze procedure eisen die verschillen van die voor standaard injectie in bevruchte eicel bij 0-30 MPF. Belangrijk voor eicel injectie is de noodzaak om de injectie uit te voeren onder omstandigheden die niet leiden tot voortijdige activering eieren, zoals in Leibovitz L-15 medium 22, 23. Omdat ze zijn ingebed in de eierstokken, rijpen eicellen leveren ook specifieke uitdagingen voor injectie. Bovenstaand protocol stelt eerste dissociëren eicellen uit de eierstokken en houden elkaar gedissocieerd oöcyt afzonderlijk met een tang tijdens het injecteren. Deze techniek heeft goed gewerkt en maakt voorsortering eicellen in de juiste fase met een minimale handling. Alternatieve methoden kunnen ook worden gebruikt, zoalszoals: i) het plaatsen van eicellen in standaard injectie agarose troggen 15, waarbij de verticale wanden van de goot drager de eicel gedurende de injectie (in deze alternatieve methode moet de oöcyten worden overgedragen aan injectie platen tijdens bewaard in vitro rijping medium) en ii ) waardoor de oöcyten aan de ovariële massa, die met een pincet in de injectie kan worden gehouden om contact met de geïnjecteerde eicel (deze aanpak te vermijden, de eicellen worden gedissocieerd na injectie zowel blootstelling DHP vergemakkelijken blijven en hun defolliculation toestaan , zich van cruciaal belang voor IVF). Ondanks deze specifieke uitdaging kan stadium IV oocyten gemakkelijk worden gepenetreerd met een injectienaald, waarschijnlijk omdat het chorion membraan in dit stadium niet volledig ontwikkeld 9. Een beperking van de huidige rijping protocol dat in vitro maturatie omstandigheden die goede eicel ontwikkelingkan niet worden gemaakt wanneer oöcytrijping wordt geïnitieerd in de stadia vroegste stadium IV. Eicellen bevoegd reageren DHP rijping ondergaan wanneer zij een diameter van 520 urn, die optreedt tijdens fase III (vitellogenese, overeenkomend met de 340 tot 690 urn range) 9 bereikt. Echter, de cultuur van fase III eicellen resultaten in eicellen die niet bevoegd is voor de bevruchting 3. Alleen eicellen waarvan de in vitro kweek wordt gestart in stadium IV (figuur 2B) kan ontwikkelen tot rijpe, stadium V oöcyten (figuur 2C en D). Dit kan verband houden met het feit dat de derde fase is essentieel voor vitellogenese en eicelkwaliteit 9. Dus de in vitro rijping van oöcyten procedure in dit artikel mag alleen worden gebruikt met een uitgangspopulatie van stadium IV eicellen (B), en niet bij oöcyten in eerdere stadia (stadium I - III; Figur e <strong&gt; 2A). Om dezelfde reden is deze werkwijze beperkt tot genen die tot expressie worden gebracht in stadium IV of hoger. De functionele manipulatie van genen waarvan de producten eerder uitgesproken in plaats daarvan moeten vertrouwen op genetische werkwijzen (zie hieronder). Verbeteringen aan cultuur in vitro rijping methoden kunnen in de toekomst mogelijk te maken voor de initiatie van eicel kweken bij eerdere stadia, waardoor de kracht van de in vitro maturatie aanpak uit te breiden. Een andere beperking in de gepresenteerde methode is dat defolliculation, die essentieel is voor de volgende stappen met betrekking tot de bevruchting, is op dit moment een snelheidsbeperkende stap in de procedure. De folliculaire membraan een transparante laag rondom de ontwikkelende eicel en verwijdering kan vervelend zijn. Als dit membraan niet volledig wordt verwijderd, zal het ei niet volledig geactiveerd en bevrucht. Dit wordt zichtbaar gemaakt door het falen van het chorion te breiden en de ontwikkeling van onregelmatig geplaatste, Voor-achtige structures (pseudocleavages), kenmerkend onbevruchte embryo 11. Enzymatische defolliculation methoden, zoals collagenase, zoals gebruikt in Xenopus, zijn geprobeerd. Echter, in onze handen, deze techniek is niet succesvol geweest, en we rekenen ook op handmatige defolliculation. Omdat handmatige defolliculation is arbeidsintensief en tijdrovend, is het moeilijk om grote hoeveelheden bevruchte eieren na in vitro rijping van oöcyten te verkrijgen. Als gevolg van de beperking opgelegd door handmatige defolliculation, we bemesten momenteel een paar defolliculated, rijpe eicellen in een tijd, in kleine series van 5-10 eieren. De opname van enzymatische defolliculation met deze procedure waarschijnlijk aanzienlijk verhogen het rendement en de algehele gebruiksgemak. Hoewel de embryo&#39;s na de bevruchting van in vitro -matured eicellen levensvatbaar volwassenen kunnen worden, merken we op dat na in vitro fertilisatie, een fractie van embryo&#39;s te doen<html> normaal of in een tijdig niet splitsen. We zijn momenteel het selecteren op lijnen waarvan de vermeerdering omvat ronden van in vitro rijping van oöcyten, wat kan leiden tot robuustere ontwikkelings- in embryo&#39;s door middel van deze methode. De procedure liet de heldere reddings- of visualisatie van eiwit lokalisatie voor een aantal mutaties 24, 25. Voor sommige genen, de regulering van productexpressie mogelijk cruciaal, zodat de producten door geïnjecteerde mRNA expressie kan leiden tot variabele resultaten 26. Ook is het belangrijk rekening te houden met alle controles (bijvoorbeeld embryo&#39;s geïnjecteerd met reagentia die vergelijkbare eigenschappen met die in het experiment nog voorspeld hebben geen effect, zoals MOS of RNA codeert alleen voor inerte eiwitten, zodanig worden als GFP), doordat de onderliggende variabiliteit kan leiden tot onjuiste conclusies. nt &quot;&gt; Een aanpak waarbij in vitro manipulatie, gevolgd door bevruchting is bijzonder bruikbaar bij de moeder afgezette producten, waarbij de standaardmethode injecteren RNA, MO of eiwit in de bevruchte eicel mogelijk niet effectief verminderen producten reeds in het ei geaccumuleerd. andere recent ontwikkelde werkwijzen, zoals CRISPR-mutant generatie, zijn ook effectief in het genereren mutant voorwaarden maternaal tot expressie gebrachte genen 26. deze wijze de groei van verschillende generaties vis vereist. de in vitro maturatie techniek maakt een snelle functionele manipulatie bestuderen van de functie van maternaal tot expressie gebrachte genen, zoals de redding en phenocopy van maternale-effect mutaties, alsmede de expressie van RNA en eiwitten in het vroege embryo.

Tijdens de ontwikkeling dier, de moeder afzettingen genproducten (bijvoorbeeld, RNA, eiwitten en andere biomoleculen) in het ei; deze producten zijn van belang voor de vroege cellulaire processen onmiddellijk na de bevruchting 1, 2. De manipulatie van de expressie en functie van maternale producten gewoonlijk ineffectief bij gebruik van een standaardbenadering voor de injectie van de reagentia in bevruchte eieren 3. Dit komt doordat de RNAs en proteïnen geproduceerd door de eicel gedurende oögenese, dus voorgeladen maternale producten zijn reeds aanwezig in de rijpe eicel. Dergelijke reeds bestaande producten zijn ongevoelig voor functionele knockdown met gen richtende middelen, zoals morfolino antisense oligo (MO&#39;s), omdat MO doel het mRNA niet de reeds bestaande eiwit reeds in het ei bij de bevruchting. Daarnaast zijn veel vroege embryonale processen gebeuren te snel na de bevruchting te influenced door eiwitproducten afkomstig van RNA geïnjecteerd in de bevruchte eicel, de RNA niet snel genoeg kan worden geproduceerd om de eerste gebeurtenissen van embryogenese beïnvloeden. Om dezelfde reden hebben fusie-eiwitten tot expressie gebracht door een mRNA injectie in het bevruchte eicel mogelijk niet op tijd beschikbaar voor visualisatie tijdens hun actieve rol in het vroege embryo. Injectie in geëxtrudeerde rijpe oöcyten vóór ei activering mogelijk maar gaat gepaard met gelijke technische problemen: zoals rijpe eieren reeds voorgeladen met maternale eiwit en zullen niet translationeel actief (dat wil zeggen, proteïne van exogene transcripten) tot na egg activering. Om deze redenen is de manipulatie van moederlijke genproducten handelend vroege embryogenese heeft gewoonlijk tijdens oögenese de rijpende eicel te voeren. Als een benadering voor het overwinnen van deze hindernissen in vitro rijping werkwijzen, waarmee de rijping van OOCYtes van stap IV ei vorming, zijn vastgesteld in de zebravis. Vroege werkwijzen toegestaan in vitro rijping, maar de verkregen rijpe eieren waren niet bevoegd is voor bevruchting 4. Vervolgens werd de manipulatie van kweekomstandigheden van neutraal tot pH 9,0, het nabootsen van de alkalische pH van de ovariële vloeistof in vissoorten 5, 6, toegestaan betrouwbaar in vitro fertilisatie (IVF) na in vitro rijping 7, 8. Inderdaad kan in vitro -matured eicellen levensvatbare embryo&#39;s die overleven tot volwassenheid en vruchtbaar 3, 8 verkregen. Deze verbeterde werkwijze is verder aangepast om de functionele manipulatie van maternale genen, de expressie van gemerkte eiwitten gedurende zebravis oögenese tot exogene expressie en omvatten MO-gemedieerde functionele knock down in matijdens stadium IV eicellen 3 (figuur 1). Zebravis oogenesis vertoont een aantal karakteristieke fasen die leiden tot de vorming van rijpe oöcyten 9 (zie tabel 1 voor een kort overzicht van de diverse stadia van oögenese). In het kort wordt eicelontwikkeling geïnitieerd door fase I eicellen en wordt gearresteerd bij de diploteen stadium van profase I van de meiose. Deze oöcyten ondergaan groei door actieve transcriptie (geïnitieerd tussen stap IA en IB), de vorming van corticale alveoli (ook bekend als corticale granules, geïnitieerd tijdens stap II) en vitellogenese (geïnitieerd tijdens stap III). Eicelkwaliteit wordt voltooid in stadium IV bij meiose I hervat, waardoor het demonteren van de eicel kern, aangeduid als de germinale vesicle (GV). Vervolgens wordt de meiose opnieuw gearresteerd op metafase II. De voltooiing van de groei en oöcyten meiotische arrest in stadium IV leidt tot een volwassen stadium V bvG9. Het verwijderen van de folliculaire membraan optreedt tijdens het vrijkomen van de eicel in het lumen van de eierstok 10 en is essentieel voor de bevruchting en de juiste ei activering. Zodra de eieren worden geëxtrudeerd uit de moeder tijdens de natuurlijke dekking, worden ze geactiveerd. In zebravis, blootstelling aan water voldoende om volledige activatie ei, onafhankelijk van de aanwezigheid van sperma 11. In vitro omstandigheden nog zorgen voor de rijping van eicellen van vroeg stadium IV-die door hun grootte (690-730 pm), de aanwezigheid van een grote GV op asymmetrische positie en een volledig ondoorschijnend uiterlijk te herkennen vanwege de accumulatie van dooiereiwitten (figuur 2B) -de volwassen stadium V ei, gekenmerkt door een volledig gedemonteerde GV en een doorschijnend uiterlijk vanwege eiwitverwerking 12 (figuur 2C) dooier. In deze benadering hele eierstokken containing eicellen in verschillende stadia van ontwikkeling worden verwijderd uit vrouwen. De eicellen mogen ontwikkelen 17α-20β-dihydroxy-4-pregneen 3-on (DHP), een doelmatige rijping inducerende hormoon 8. Gedurende deze periode kunnen rijpen eicellen worden gemanipuleerd door de injectie van expressie (bv afgedekt, in vitro -transcribed mRNA) of reverse genetics middelen (bijvoorbeeld, MO). De folliculaire laag niet spontaan werpen tegen het eind van de rijpingsperiode, dus moet handmatig worden verwijderd. Na defolliculation wordt in vitro fertilisatie bereikt door triggering ei activering door blootstelling van de eieren water (aanwezig in embryonale (E3) gemiddeld) 13 en een zaadcel oplossing. De resulterende zygoten ondergaan embryonale ontwikkeling en maken de beoordeling van het vermogen van behandelingen maternale genfunctie te manipuleren en de visualisatie en analyse van gemerkte maternale producten ( <strong&gt; Figuur 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zebrafish mating boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>SpawningBox1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td>PennPlax</td>
			<td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflective light source (LED arms)</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression glass plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beakers, 250 ml (2)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;z L-15 medium</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>for pH&#39;ing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Apparatus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tubing for injection needles</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-87</td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (1-20 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (20 - 200 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (100 - 1000 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 10 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 20 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>MR095</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for fish water:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Salt</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>&#160;CD-116528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (cell culture tested)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for E3 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4, heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Food:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td>FBSFKG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramin Flakes</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>16623</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish

Cellulaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de vroegste stadia van embryonale ontwikkeling dieren worden aangedreven door maternale genproducten gestort in de ontwikkelende eicel. Aangezien deze gebeurtenissen afhankelijk maternale producten die typisch handelen zeer snel na bevruchting-preexist dat in het ei, standaardbenaderingen voor expressie en functionele beperking met betrekking tot de injectie van de reagentia in bevruchte eicel zijn meestal ineffectief. In plaats daarvan moeten dergelijke manipulaties worden uitgevoerd tijdens oögenese, vóór of tijdens de accumulatie van maternale producten. Dit artikel beschrijft in detail een protocol voor de in vitro rijping van onrijpe eicellen zebravis en de daaropvolgende in vitro fertilisatie, waarbij levensvatbare embryo&#39;s die overleven naar volwassenheid. Deze methode kan de functionele manipulatie van maternale producten tijdens oögenese, zoals de expressie van producten voor fenotypische reddings- en gelabeld construct visualisatie, alsmede eenTussen de vermindering van genfunctie door middel van reverse-genetica middelen.

Om te bepalen of de bovenbeschreven procedure succesvol is, kan het embryo tijdens de afsplitsing stappen nemen om het uiterlijk van de stereotiepe vroege embryonale splitsing patroon 18 te bevestigen, en 24 uur na de bevruchting (HPF) om de juiste ontwikkeling te bevestigen van het basislichaam plan. Deze procedure maakt de manipulatie van maternale producten voor functionele studies door de injectie van reagentia, zoals mRNA en MO tijdens eicelontwikkeling. Manipulatie van de moeder producten voor functionele studies: mRNA dat codeert voor wild-type en gemuteerde producten kunnen worden geïnjecteerd in oöcyten in vitro rijpen om het effect van het manipuleren van maternale genfunctie testen tijdens de meiose en de vroege embryonale stadia. Bijvoorbeeld kunnen wildtype embryo&#39;s worden geïnjecteerd met wild-type mRNA te testen voor het effect van overexpressie product, of mutant RNA te testen op mogelijke dominant (bv gain-of-function en antimorphic) effecten bij deze werkwijzen. Eicellen in in vitro kweek kunnen eiwitten gedurende oöcytontwikkeling produceren van exogeen mRNA, zoals de expressie van GFP van geïnjecteerde mRNA, hoewel slechts oöcyten die kweekomstandigheden initiëren in stadium IV van oogenesis kunnen uitgroeien tot volwassen stadium V oöcyten (figuur 2B -2D, zie ook Nair et al. 3). De expressie van wildtype product via geïnjecteerde mRNA ook een hulpmiddel voor het redden van maternale-effect mutaties gen identiteit te bevestigen tijdens positionele klonering 3, 24. In dit geval wordt wildtype mRNA geïnjecteerd in oöcyten van homozygote mutantvrouwtjes te testen of wild-type producten het mutante fenotype te redden. Deze genetische rescue wordt geïllustreerd in &lt;strong&gt; Figuur 3A-3C, wanneer geïnjecteerd AurB mRNA is aangetoond dat het fenotypische effect van een mutatie redden in het overeenkomstige gen cellulaire eiland (CEI) (Figuur 3A-3C). De embryo&#39;s uit een controlegroep mogen ook ontwikkelen tot het overeenkomstige mutante fenotype 3 tonen. Mutant RNA kan ook worden geïnjecteerd in oöcyten mutant te testen of de gemuteerde product behoudt deelfunctie door vergelijking van de mate van redding die welke wordt veroorzaakt door het wild-type product. Eiwitexpressie uit mRNA geïnjecteerd in oöcyten ontwikkeling blijkt plaats te vinden met weinig of geen vertraging. Sterke GFP expressie waargenomen binnen 2 uur na de injectie van het overeenkomstige mRNA, ongeacht het ontwikkelingsstadium van de eicel 3 (Figuur 2B-2D, zie ook Nair et al. 3). Producten zoals mCherry:SAS6 en Birc5b (Motley): GFP kan direct worden waargenomen na de bevruchting en de eerste embryonale celcyclus 3, 25. De injectie van mRNA tijdens oögenese leidt ook tot de productie van eiwitten die, ongeacht de gecondenseerde gemerkte rest, functioneel direct na de bevruchting, zoals bij maternale producten voor mobiele island / aurB 3, nutteloze cyclus / lrmp 24 en bonte / bir5b 25. Vertaling-blokkerende MO werking ook direct na de bevruchting, zoals weergegeven nutteloze cyclus / Lrmp 3 en in latere stadia van de embryogenese, zoals bij mission impossible / dhx16 3. Splice-blokkerende MO, wanneer geïnjecteerd in oöcyten rijpen, kan geen effect op de maternale functie waarschijnlijk door reeds aanwezige oudere maternale transcripten in fase IV eicellen &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Genereren van morphants: Bij gebruik van een MO overeenkomt met een gen met een reeds geïdentificeerde mutatie, is de morphant fenotype verwacht dat het mutante fenotype na te bootsen. Morfants vergeleken met niet-geïnjecteerde embryo&#39;s die geïnjecteerd met een standaard, controle MO. De injectie van een translatie-blokkerende morfolino succes kan phenocopy bekende mutant fenotype 3, zoals door injectie van Lrmp MO in oöcyten die het mutante fenotype van de overeenkomstige mutatie nutteloze cyclus (Figuur 3D-F) nabootst. De specificiteit van MO&#39;s kunnen worden bepaald door dezelfde methoden toegepast bij het injecteren MO tot embryo&#39;s (voorheen beoordeeld) 19 20. Expressie van fluorescent gelabelde fusie-eiwitten: mRNA dat codeert voor de genproducten van interesse gefuseerd aan fluorescente eiwitten (bijvoorbeeld GFP en mCherry) kan ook worden geïnjecteerd in ofwel wild-type of mutant oöcyten in de overeenkomstige producten zichtbaar in het vroege embryo (dat wil zeggen, als gevolg van een subcellulaire lokalisatie patroon Figuur 3G en 3H). mRNA coderend voor soortgelijke fusies, maar waarbij het mutante allel kan op soortgelijke wijze worden uitgedrukt om te testen of de mutatie beïnvloedt eventuele subcellulaire lokalisaties. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig1.jpg" /> Figuur 1: in vitro rijping van oöcyten. Schematische weergave van de verschillende stappen van in vitro rijping van oöcyten. Volwassen vrouwtjes zijn vooraf geselecteerd voor leg 8 dagen voorafgaand aan de procedure, om ze te zuiveren van de eieren reeds vervallen en promote nieuwe eicel ontwikkeling. De eierstokken, bevattende ontwikkelen oöcyten zijn van koeien verwijderd en overgebracht naar een medium dat het hormoon DHP rijping van oöcyten te induceren in vitro. Na verwijdering van koeien en onmiddellijk voor of tijdens oöcytmaturatie, kunnen oöcyten worden geïnjecteerd met RNA en andere reagentia voor de functionele manipulatie van maternale factoren. Rijpe oöcyten worden handmatig defolliculated en in vitro bevrucht met een zaadcel oplossing bevrucht, levensvatbare embryo&#39;s verkregen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig2.jpg" /> Figuur 2: In vitro maturatie en expressie van Producten uit geïnjecteerd mRNA. (A) oöcyten in stadium I-III, waargenomen in eierstokkenvrouwtjes 4 dagen na zuivering (DPP). (B) oöcyten in stadium IV, waargenomen in eierstokken van vrouwen 8 dpp. De germinale vesicle (GV, pijl) is duidelijk zichtbaar en neemt een excentrische positie. De fase III eicellen in (A) vertonen eveneens een duidelijker GV, maar wordt gevonden in het midden van de eicel. Fase IV eicellen in (B) hebben een oppervlakte die bijna maximale vergeleken met die van rijpe eicellen in (C). (C en D) oöcyten in stadium V (rijpe oocyten) na 2 uur in vitro maturatie omstandigheden geïnitieerd in stap IV zoals in (B), en geïnjecteerd tijdens de rijping met GFP coderende, in vitro getranscribeerde mRNA (C, zichtbaar licht alleen D, bekleding van zichtbaar licht en GFP fluorescentie). De GV is niet langer zichtbaar in stadium V oocyten die ook minder dan opaak stadium IV oöcyten. Geïnjecteerde eicellen uiten GFP-eiwit (D). Defolliculation van volwassen stadium IV eicellen is described in het gedeelte protocol. Schaal bar = 300 urn. Alle panelen werden gereproduceerd, met toestemming, van Nair et al 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig3.jpg" /> Figuur 3: manipulatie en visualisatie van Maternal Producten via in vitro rijping van oöcyten. (A - C) Redding van de maternale-effect fenotype veroorzaakt door een mutatie in cellulaire eiland / aurora B door de injectie van wildtype aurB mRNA in stadium IV cei / aurB eicellen. Samengevoegde beelden die dierlijke uitzicht 65 MPF vaste blastodiscs, zichtbaar gemaakt met anti-ß-catenine antilichamen aan membranen (groen) te markeren, anti-α-tubuline antilichamen tegen microtubuli geven (rood) en DAPI DNA (blauw) wijzen. (A) β-catenine accumulatie in wildtype embryo&#39;s, indicatief voor normale furrow rijping. (B) A cei / aurB embryo uit een niet-geïnjecteerde cei / aurB stadium IV oöcyten toont gedeeltelijk rudimentaire voren dat geen β-catenine kan accumuleren. (C) A geredde cei / aurB embryo van een cei / aurB oöcyt geïnjecteerd met wildtype aurB mRNA blijkt robuuste β-catenine accumulatie in de voren. (D - F) Phenocopy van de maternale-effect veroorzaakt door een mutatie in nutteloze cyclus / lrmp de injectie van Lrmp morfolino in stadium IV eicellen. Samengevoegde beelden die dierlijke uitzicht 70 MPF vaste blastodiscs, zichtbaar gemaakt met anti-γ-tubuline antilichamen tegen centrosomes (rood) en DAPI aangeven DNA (blauw) wijzen. (D) In wildtype embryo&#39;s, elke kern associeert met γ-tubuline, een marker voor centrosomal materiaal. (E) In maternale-effect FUE mutanten, pronucleaire fusie mislukt, waardoor 2-3 stukjes DNA labels overeenkomen met niet-gefuseerde ouderlijke pro-nuclei en het polaire lichaam meiose II. (F) In Lrmp morphants, waarbij maternale Lrmp functie wordt geremd, de kernen namelijk eveneens niet delen en bovendien niet te associëren met γ-tubuline. (G en H) Visualisatie van maternaal verkregen product in het vroege embryo. Sass6 mCherry-eiwit van exogeen mRNA geïnjecteerd in stadium IV eicellen lokaliseert de centriolen. Samengevoegde beelden die dierlijke uitzicht 40 MPF vaste blastodiscs, zichtbaar gemaakt met anti-γ-tubuline antilichamen tegen centrosomes (groen) te markeren, mCherry fluorescentie Sass6 (rood) geven en DAPI DNA (blauw) wijzen. (G) Uitgedrukt Sass6-mCherry eiwit lokaliseert foci gelabeld door centrosome marker γ-tubuline op plaatsen aan weerszijden van de kern (pijl). (H </strong&gt;) Dezelfde afbeelding, waarin slechts Sass6-mCherry en DAPI voor de duidelijkheid. De embryo (G en H) zijn bevestigd, maar de fluorescentie van expressie, zoals mCherry fusies kunnen ook in levende embryo&#39;s waargenomen (niet getoond). Schaal bar = 100 urn AF en 10 urn G en H. Alle panelen gereproduceerd met toestemming van Nair et al 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stadia van Oogenesis </td><td> Oöcytdiameter (pm) </td><td> Key landmark (s) </td></tr><tr><td> 1A - Prefollicle </td><td> 7-20 </td><td> Initiatie van actieve transcriptie accumulatie van nucleoli </td></tr><tr><td> 1B - Follikel </strong&gt; </td><td> 20-140 </td><td> Decondensatie chromosomen </td></tr><tr><td> II - Corticale alveole </td><td> 140-340 </td><td> Corticale alveoli productie </td></tr><tr><td> III - vitellogenese </td><td> 340-690 </td><td> Verdonkering van oöplasma door accumulatie van dooier voorlopereiwit en lipiden </td></tr><tr><td> Vroege IV - oöcytmaturatie </td><td> 690-730 (lager bereik) </td><td> Asymmetrische lokalisatie van kiemblaasje </td></tr><tr><td> Vroege IV - oöcytmaturatie </td><td> 690-730 (hoger bereik) </td><td> Kiemblaasje verdwijnt, arrestatie bij metafase II </td></tr><tr><td> V - Mature eicel </td><td> ~ 750 </td><td> Oöplasma / dooier doorschijnend </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Landmarks of oöcytontwikkeling in Zebravis.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish at JoVE.com

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Een geoptimaliseerd protocol voor de in vitro rijping van oöcyten zebravis gebruikt voor het manipuleren van moederlijke genproducten wordt hier gepresenteerd.

Functionele Manipulatie van Maternal Gene producten met behulp van<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturatie van zebravis

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mozaïek zebravis Transgenese voor Functioneel genomische analyse van de kandidaat-coöperatieve genen in Tumor Pathogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo&#39;s met Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Nanoparticle-gemedieerde siRNA Gene-zwijgen in volwassen Zebrafish hart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...