Name: functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish
Uploaded: 2017-04-22T13:00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории и рыбы управленческого персонала учреждения Пелегри, которые сыграли важную роль в содействии этому проекту. Поддержка данного проекта была предоставлена ​​NIH R56 GM065303 и NIH 2 T32 GM007133 к РПД, NIH 5 F31 GM108449-02 и NIH 2 T32 GM007133 к CCE, и NIH RO1 GM065303 к FP

<ol>
	<li>Lindeman, R., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+maternal-effect+genes:+insights+into+fertilization,+early+cleavage+divisions,+and+germ+cell+determinant+localization+from+studies+in+the+zebrafish.">Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish.</a> Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).</li><li>Abrams, E. W., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+development:+it's+in+the+maternal+genes.">Early zebrafish development: it's in the maternal genes.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).</li><li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes.">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).</li><li>Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+for+oocyte+maturation+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).</li><li>Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+assessment+of+overripening+in+turbot+(Scophtalmus+maximus)+by+a+simple+pH+measurement.">Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement.</a> Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).</li><li>Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+ovarian+fluid+in+4+salmonid+speices:+Onchorhynchus+mykiss,+Salmo+trutta+flacustris,+Salvelinus+alpinus+and+Husho+hucho.">Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho.</a> Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).</li><li>Pati&#241;o, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+pH+on+hormonally+regulated+ovarian+follicle+maturation+and+ovulation+in+Atlantic+croaker.">Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker.</a> Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).</li><li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes.">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).</li><li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine/paracrine+control+of+zebrafish+ovarian+development.">Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development.</a> Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).</li><li>Kane, D. A., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+midblastula+transition.">The zebrafish midblastula transition.</a> Development. 119 (2), 447-456 (1993).</li><li>Kanagaraj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Souffle/Spastizin+controls+secretory+vesicle+maturation+during+zebrafish+oogenesis.">Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).</li><li>Brand, M., Granato, M., N&#252;sslein-Volhard, C., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+oocyte+growth+and+vitellogenin+gene+expression+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).</li><li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment.">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> J Vis Exp. , (2016).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+zebrafish.">Stages of embryonic development in the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+with+the+old,+in+with+the+new:+reassessing+morpholino+knockdowns+in+light+of+genome+editing+technology.">Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology.</a> Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).</li><li>Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+for+mutations+affecting+adult+traits+and+parental-effect+genes.">Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes.</a> Meth Cell Biol. 135, (2016).</li><li>Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+products+of+futile+cycle/lrmp+promote+centrosome-nucleus+attachment+in+the+zebrafish+zygote.">Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote.</a> Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).</li><li>Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosomal+passenger+protein+Birc5b+organizes+microfilaments+and+germ+plasm+in+the+zebrafish+embryo.">The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo.</a> PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).</li><li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aura+(mid1ip1l)+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition.">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Выше протокол для манипуляции генных продуктов до оплодотворения, таким образом, позволяя при изучении продуктов материнских генов в раннем данио эмбриона. Предыдущие исследования были в состоянии зрелых ооцитов в пробирке 4; этот протокол был изменен , чтобы для последующего оплодотворения в пробирке созревшей яйцеклетки 8. Это , в свою очередь , позволяет инъекции реагентов для функциональной манипуляции и визуализации матерински унаследованных продуктов в раннем эмбрионе 3. Эмбрионы в результате этого метода могут быть жизнеспособными и могут выжить, чтобы стать плодородными взрослыми. В предварительных экспериментах, примерно половина из оплодотворенных эмбрионов, полученных от этой процедуры была жизнеспособной на 5-е дня развития, по оценке инфляции плавательного пузыря на ту стадию, примерно половина из которых стали здоровыми, плодородными взрослые (неопубликованные наблюдения). Есть целый рядиз важных шагов, чтобы рассмотреть в протоколе. Ооциты на соответствующем этапе, чтобы инициировать созревание (ранняя стадия IV) может быть обогащен, если женщина была повязана недавно, но не раньше, чем 8 ДПП. Использование рыбы , которые не повязаны в последнее время, может привести к вырождаются яйцами 14, которые не претерпевают созревание. Женщины повязаны в течение менее чем за 8 дней будут иметь большинство яиц на стадии III или меньше, и , таким образом, яйца не созреют должным образом в лабораторных условиях . Яичники у женщин, которые спаренные за 8 дней до будут иметь оптимальную долю ооцитов в ранней стадии IV. Они могут быть признаны их непрозрачностью и наличием GV в эксцентрической позиции (фигура 2В). Определение стадии ооцитов также может быть оказано помощь путем измерения размера, с ооцитами помещали на градуированный микрометр слайд под микроскопом , и по сравнению со стандартными руководящими принципами стадирования (таблица 1). Однако ранняя стадия IV ооциты имеют почти максимальный размер по сравнению с зрелымооциты (распознаваемые их относительная прозрачность и отсутствие GV; Рисунок 2C) и легко узнаваемы, как описаны выше, которые , как правило , устраняет необходимость прямого измерения размера ооцитов. В пробирке созревания должна начаться в течение нескольких часов после окончания цикла дневного света , к которому приспособились женские доноры ооцитов. Яйцеклетки не созревают должным образом, отражается в низкой скорости оплодотворения, если культивировать в утренний период светового цикла. Причина циркадных зависимости от ооцитов в пробирке метода созревания не поняла , но , вероятно , отражает основные циркадные искажения в естественных условиях яичного созревания с участием велосипедной экспрессии генов во время оогенеза 21. Общая причина для ооцитов не суметь пройти успешным в пробирке созревания, несмотря на надлежащих ооцитах постановки является то , что ДГП истекло. DHP гормон обычно истекает через год, и, чтобы обеспечить эффектив созревание, рабочая партия должна быть заменено в течение 9 месяцев использования. Инъекции ооцитов является еще одним важным шагом, когда цель метода является функциональной манипуляции материнских продуктов. Эта процедура имеет требование, которые отличаются от стандартных инъекций в оплодотворенной яйцеклетке в 0-30 МПФЕ. Ключевым фактором в инъекции ооцитов является необходимость проводить инъекции в условиях , которые не приводят к преждевременной активации яйца, например, в L-среде 15 Лейбовиц 22, 23. Потому что они встроены в яичниках, созревающие ооциты также создают особые проблемы для инъекций. Протокол выше предполагает первую диссоциацию ооцитов из яичников, а затем, держа друг диссоциированы ооцит отдельно пинцет при введении. Этот метод работает хорошо и позволяет предварительно сортировать ооциты на соответствующей стадии с минимальной обработкой. Альтернативные методы могут быть также использованы, напримеркак: я) размещение ооциты в стандартную инъекцию агарозного желоба 15, где вертикальные стенки опоры желоба ооцита во время инъекции (в этом альтернативном способе, ооциты должны быть переданы для инъекций пластин в то время хранится в экстракорпоральном созревании среды) и II ), что позволяет ооциты оставаться прикреплены к массе яичников, который можно удерживать с пинцетом во время инъекции, чтобы избежать контакта с закачиваемой ооцита (в данном подходе, ооциты должны быть отделены после инъекции и облегчения воздействия DHP и позволить их defolliculation , сам по себе важно для ЭКО). Несмотря на эту конкретную задачу, стадия IV ооциты могут быть легко проникали с инъекционной иглой, вероятно , потому , что хорионический мембрана на этой стадии не полностью развита 9. Одним из ограничений текущего протокола созревания является то , что в лабораторных условиях созревания , которые способствуют правильному развитию ооцитовне может быть создано, когда созревание ооцитов инициируются на этапах раньше, чем стадия IV. Яйцеклетки стать компетентным , чтобы ответить на DHP, подвергаясь созревания , когда они достигают диаметра 520 мкм, которое происходит во время стадии III (вителлогенеза, что соответствует диапазону от 340 до 690-мкм) 9. Тем не менее, культура стадии III ооцитов результатов в ооцитах, которые не являются компетентными для оплодотворения 3. Только ооцитов в пробирке которого культура начинается на стадии IV (фиг 2В) может развиться в зрелые, этап V ооцитов (рис 2C и D). Это может быть связано с тем , что стадия III имеет важное значение для вителлогенеза и ооцитов роста 9. Таким образом, процедура пробирки созревания ооцитов в представленной в этой статье , должна быть использована только с начальным населением стадии IV ооциты (B), а не с ооцитами на более ранних стадиях (стадия I - III; Figur е <strOng&gt; 2A). По той же причине, эта процедура ограничивается генами, которые экспрессируются на стадии IV или более поздней версии. Функциональное манипулирование генов, продукты которых выражены ранее, может вместо того, чтобы полагаться на генетических методов (см ниже). Усовершенствование методов в пробирке культура созревания в будущем могут позволить для инициации ооцитов культивирования на более ранних стадиях, тем самым расширяя мощность экстракорпорального созревания подхода. Другое ограничение в представленном способе является то, что defolliculation, что очень важно для последующих стадий, включающих оплодотворение, в настоящее время является лимитирующей стадия в процедуре. Фолликулярная мембрана представляет собой прозрачный слой, окружающий развивающийся ооцит, и удаление может быть утомительным. Если эта мембрана не полностью удалена, яйцо не будет полностью активирована и оплодотворены. Это стало очевидным провалом хориона расширения и развития неравномерно размещены, по бороздам-го типаructures (pseudocleavages), характерный для неоплодотворенных эмбрионов 11. Ферментативные методы defolliculation , такие как коллагеназы, используемая в Xenopus, были опробованы. Тем не менее, в наших руках, эта техника не была успешной, и поэтому мы полагаемся на ручной defolliculation. Поскольку руководство defolliculation является трудоемким и отнимающим много времени, трудно получить крупные партии оплодотворенных яиц после экстракорпорального созревания ооцитов. Из-за временного ограничения, введенного вручную defolliculation, мы в настоящее время оплодотворить несколько defolliculated, зрелые яйца, в то время, небольшими партиями по 5-10 яиц. Введение ферментного defolliculation с этой процедурой, вероятно, значительно повысить его производительность и общую простоту использования. Хотя эмбрионы , полученные после оплодотворения -matured ооцитов в пробирке могут стать жизнеспособными взрослыми, мы отмечаем , что после оплодотворения в пробирке, доля эмбрионов делать<html> не разъединять нормально или своевременно. Мы в настоящее время для выбора линий, включает в себя распространение раундов в пробирке созревания ооцитов, которые могут привести к более надежным моделям развития у эмбрионов , полученных с помощью этого метода. Процедура позволила ясном спасения или визуализации локализации белка для ряда мутаций 24, 25. Тем не менее, для некоторых генов, регуляция экспрессии продукта может иметь решающее значение, так что продукты , выраженные впрыскиваемый мРНК могут привести к переменным результатам 26. Важно также иметь в виду все элементы управления (например, эмбрионы , инъецированные с реагентами , которые имеют аналогичные свойства, используемые в эксперименте , пока, по прогнозам, не производить эффект, таких как контроль ОЧ или РНК , кодирующих только для инертных белков, таких , в GFP), поскольку основная изменчивость может привести к неправильным выводам. нт &quot;&gt; Подход с участием манипуляции в пробирке с последующим оплодотворением является особенно полезным в случае материнским осажденных продуктов, где стандартный метод инъекционного РНК, MOS, или белок в оплодотворенной яйцеклетки не может эффективно снижать продукцию уже накопленных в яйце. Другие недавно разработанные методы, такие как CRISPR-мутант поколение, также являются эффективными при создании мутантного условия для материнский экспрессируемых генов 26. Тем не менее, этот метод требует ростов нескольких поколений рыб. методика созревание ооцитов в пробирке позволяет быстро функциональную манипуляцию с изучения функции матерински экспрессируемых генов, в том числе аварийно-спасательных и фенокопии материнской-эффект мутаций, а также экспрессии РНК и белков в ранних эмбрионов.

Во время развития животных, материнские отложения генные продукты (например, РНК, белки и другие биомолекулы) в яйце; эти продукты имеют важное значение для ранних клеточных процессов сразу после оплодотворения 1, 2. Манипуляции экспрессии и функции материнских продуктов , как правило , неэффективны при использовании стандартного подхода для введения реагентов в оплодотворенных яйца 3. Это происходит потому, что большинство РНК и белки получают ооцита во время оогенеза, так что предварительно загружены материнские продукты уже присутствуют в зрелом яйце. Такие продукты, существующие ранее непроницаемы для функционального нокдауна с генными ориентации агентами, такими как морфолино антисмысловых олигонуклеотидов (MOS), потому что целевой МО мРНК, а не существовавшие ранее уже присутствует белок в яйце при оплодотворении. Кроме того, многие ранние эмбриональные процессы происходят слишком быстро после оплодотворения быть influenКНИ с помощью белковых продуктов, полученных из РНК, введенного в оплодотворенной яйцеклетки, поскольку РНК не может быть получен достаточно быстро, чтобы повлиять на первые события эмбриогенеза. По той же причине, меченый белок слияния, выраженные через инъекции мРНК в оплодотворенной яйцеклетки, не может быть получен во времени для визуализации во время их активной роли в раннем эмбрионе. Инъекция в экструдированных зрелых ооцитов до активации яйца возможно , но связано с подобными техническими вопросами: такие зрелые яйца уже предварительно загружены с материнским белка, и они никогда не станут поступательно активными (то есть, производят белок из экзогенных транскриптов) до тех пор , после того, как яйца активация. По этим причинам, манипулирование продуктов материнских генов, действующих в начале эмбриогенеза обычно необходимо проводить во время оогенеза в вызревании яйцеклетки. В качестве одного подхода к преодолению этих препятствий, в пробирке методы созревания, которые позволяют созревание МНКАytes от стадии IV до формирования яйца, были созданы в данио. Ранние методы позволили в пробирке созревания, но в результате зрелых яйца не компетентны для оплодотворения 4. Затем манипуляции условий культивирования от нейтрального до рН 9,0, имитируя щелочной рН жидкости яичников , найденного в видов рыб , 5, 6, разрешенный для надежного экстракорпорального оплодотворения (IVF) после созревания в пробирке 7, 8. Действительно, в пробирке -matured ооциты могут давать жизнеспособные эмбрионы , которые выживают к взрослой жизни , и что плодородные 3, 8. Этот усовершенствованный метод был дополнительно выполнен с возможностью включать в себя функциональные манипуляции материнских генов, экспрессию меченных белков во время данио оогенеза через экзогенную экспрессию и Мо-опосредованный функционально сбить в матеэтап IV ооцитов тора 3 (фиг.1). Рерио оогенез имеет ряд характерных этапов , ведущих к образованию зрелых ооцитов 9 (см таблицу 1 для краткого руководства на различных этапах в оогенезе). Вкратце, развитие ооцитов инициируют стадии I ооцитов и арестовывают на диплотене профазы I мейоза. Эти ооциты подвергаются росту посредством активной транскрипции (инициированного во время стадий IA и IB), образование кортикальных альвеол (также известное как кортикальные гранулы, инициированных во II стадии) и вителлогенез (инициированный во время этапа III). Рост ооцитов завершается на стадии IV, когда я мейоза резюме, в результате разборки ядра ооцита, именуемой зародышевым пузырьком (GV). Впоследствии, мейоз снова арестован в метафазе II. Завершение роста ооцита и остановку мейоза на стадии IV приводит к зрелой стадии V, например,г 9. Удаление фолликулярной мембраны происходит во время высвобождения ооцита в просвет яичник 10 и имеет важное значение для оплодотворения и надлежащей активации яйца. После того, как яйца выдавливаются от матери во время естественного спаривания, они становятся активированными. В данио, воздействие воды достаточно для полной активации яйца, независимо от наличия спермы 11. В пробирке условий в настоящее время допускают созревание ооцитов от ранней стадии IV-которые могут быть признаны по их размерам (690-730 мкм), в присутствии большого GV в асимметричном положении, а также полностью непрозрачным внешний вид из - за накопление желток белков (Фигура 2В) -в зрелой стадии V яйца, характеризующиеся полностью разобранном GV и полупрозрачный внешний вид из - за обработки белка желток 12 (рис. 2в) При таком подходе целые яичники продAining ооцитов на разных стадиях развития, удаляются от самок. В ооциты могут развиваться в 17α-20β-дигидрокси-4 прегнен-3-она (DHP), эффективного гормона 8 созревания индуцирующие. В течение этого периода созревания ооциты можно манипулировать посредством инъекции экспрессии (например, ограничен, в пробирке -transcribed мРНК) или обращенно-генетика агенты (например, MOS). Фолликулярная слой не самопроизвольно пролила к концу периода созревания, поэтому он должен быть удален вручную. После того, как defolliculation, оплодотворение в пробирке достигается путем запуска активации яйца через воздействия яиц в воде (присутствует в зародыше (Е3) среды) 13 и раствора спермы. Полученные в результате зиготы подвергаются эмбрионального развития и позволяют для оценки способности лечения манипулировать функции гена материнской и для визуализации и анализа меченых материнских продуктов ( <strong&gt; Рисунок 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zebrafish mating boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>SpawningBox1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td>PennPlax</td>
			<td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflective light source (LED arms)</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression glass plate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beakers, 250 ml (2)</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;z L-15 medium</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td>for pH&#39;ing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Apparatus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tubing for injection needles</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-87</td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (1-20 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (20 - 200 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetor (100 - 1000 &#181;l range) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 10 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic pipette 20 ml with bulb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>MR095</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for fish water:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Salt</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>&#160;CD-116528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (cell culture tested)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for E3 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4, heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish Food:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td>FBSFKG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramin Flakes</td>
			<td>Drs. Foster &#38; Smith</td>
			<td>16623</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish

Клеточные события, которые происходят на ранних стадиях эмбрионального развития животных обусловлены матерински полученных генных продуктов, депонированных в развивающуюся яйцеклетку. Поскольку эти события зависят от материнских продуктов, которые, как правило, действуют очень скоро после оплодотворения, что внутри существовать до яйца, стандартные подходы для экспрессии и функциональной редукции, включающие введение реагентов в оплодотворенную яйцеклетку, как правило, неэффективны. Вместо этого, такие манипуляции должны быть выполнены во время оогенеза, до или во время накопления материнских продуктов. В данной статье подробно описывается протокол для созревания в пробирке незрелых ооцитов данио и их последующего оплодотворения, получая жизнеспособные эмбрионы , которые выживают к взрослой жизни. Этот метод позволяет функциональное манипулирование материнских продуктов во время оогенеза, таких как выражение продуктов для фенотипического спасения и помеченной визуализации конструкта, а такжеево снижение функции гена с помощью обращенно-генетических агентов.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish at JoVE.com

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Оптимизированный протокол для созревания в пробирке данио ооцитов , используемых для манипуляции продуктов материнских генов представлен здесь.

Функциональная Манипуляция материнских генных продуктов с помощью<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание ооцитов в данио рерио

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Манипуляция и<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; ооциты, а затем внутриклеточное инъекции сперматозоида в целях изучения эмбрионального развития

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Мозаика данио рерио Трансгенез для функционального геномного анализа потенциальных совместных генов в опухолевых патогенеза

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Плоидность Манипуляция эмбрионов данио рерио с теплового шока 2 Лечение

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Созревание стволовых клеток человека, полученных кардиомиоцитов в Biowires Использование электрической стимуляции

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

В пробирке Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Наночастицы опосредованной siRNA сайленсинга генов в сердце взрослого человека данио рерио

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...