Name: preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography at JoVE.com

This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

सावधानी: उन्हें उपयोग करने से पहले विभिन्न अभिकर्मकों की सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDSs) से परामर्श करें। नमूना तैयार करने के दौरान प्रयुक्त रसायनों के कई, और / या reprotoxic, विषाक्त कैंसर, mutagenic हैं। एक धूआं हुड क?...

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	<li>De Rosier, D. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+three+dimensional+structures+from+electron+micrographs.">Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs.</a> Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).</li><li>Gan, L., Jensen, G. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+spreading+and+spatial+resolution+in+thick+organic+specimens.">Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).</li><li>Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STEM+tomography+for+thick+biological+specimens.">STEM tomography for thick biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).</li><li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+STEM+tomography+acquisition--a+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography.">Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li><li>Hovden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Crowther+limit:+combining+depth-sectioning+and+tilt+tomography+for+high-resolution,+wide-field+3D+reconstructions.">Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions.</a> Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).</li><li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+transmission+electron+microscopy+tilt-+and+focal+series.">Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series.</a> Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).</li><li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens.">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li><li>Weyland, M., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+convergence+angle+for+optimum+STEM+performance.">Tuning the convergence angle for optimum STEM performance.</a> FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker-free+image+registration+of+electron+tomography+tilt-series.">Marker-free image registration of electron tomography tilt-series.</a> BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).</li><li>Kohl, L., Bastin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flagellum+of+trypanosomes.">The flagellum of trypanosomes.</a> Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).</li><li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+epoxy+resin+embedding+methods.">Improvements in epoxy resin embedding methods.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).</li><li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+Transmission+Electron+Microscopy:+preparation+of+biological+samples.">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li><li>Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+depth+of+field+for+high-resolution+scanning+transmission+electron+microscopy.">Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy.</a> Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).</li><li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ettention+software+package.">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography.">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles.">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li><li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy.">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041 (2016).</li></ol>

इस अनुच्छेद में, हम के माध्यम से फोकल टोमोग्राफी स्टेम का उपयोग कर मोटी जैविक नमूने पर 3 डी विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड के साथ एक पारंपरिक नमूना तैयार प्रोटोकॉल उपस्थित थे। जैविक नम?...

1970 के दशक के बाद से, टोमोग्राफी संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) व्यापक रूप से जैविक नमूनों 1, 2, 3 की संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है में दृष्टिकोण। संचरण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी की अपील है कि यह कोशिकाओं की वास्तुकला और macromolecular परिसर और प्रोटीन की संरचना करने के लिए अंगों की फैटी से nanometer पैमाने पर जैविक संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता था। फिर भी, संचरण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी बहुत मोटी नमूने (अधिक से अधिक 0.5 माइक्रोन) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। दरअसल, मोटी नमूनों भी कई बिखर इलेक्ट्रॉनों का उत्पादन, कम संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) छवियों पैदा होता है। इसके अलावा, टोमोग्राफी नमूना झुकाव कोण के साथ बढ़ के स्पष्ट मोटाई के साथ, झुका नमूनों की छवियों का संग्रह शामिल है। हालांकि स्थिर बिखरने फ़िल्टर किया जा सकताऊर्जा फिल्टर का उपयोग कर बाहर, उच्च SNR छवियों के लिए आवश्यक इलेक्ट्रॉनों की आलोचना की राशि मात्र मंदिर में पहुँच जाता है। इसलिए, मोटी जैविक नमूनों केवल सेक्शनिंग 4 का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। कुछ नमूने कटा हुआ नहीं किया जा सकता: कुछ जब वे काट रहे हैं नीचा हो सकता है, और दूसरों के क्रम में उनकी जटिलता को समझने के लिए अपनी संपूर्णता में अध्ययन किया जा करने की जरूरत है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण स्कैनिंग मोड 5, 6, 7, 8 में मंदिर का प्रयोग है। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) स्कैनिंग में, इलेक्ट्रॉनों की ऑप्टिकल पथ कि पारंपरिक मंदिर में से अलग है। इलेक्ट्रॉनों बिखरने के बिना नमूना के माध्यम से गुजर रहा है, एक उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) डिटेक्टर 9 के साथ ऑप्टिकल अक्ष पर एकत्र किया जा सकता लचीलेपन से बिखरे हुए उन एक काले क्षेत्र (डीएफ) डिटेक्टर के साथ ऑप्टिकल धुरी से एक खास कोण पर एकत्र किया जा सकता है, जबकि।स्टेम के अन्य लाभ यह है कि ध्यान केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम नमूना की सतह पर जांच होती है, छवियों के पिक्सेल द्वारा पिक्सेल संग्रह सक्षम करने के लिए है। हालांकि इलेक्ट्रॉन बीम, जबकि नमूना 10 के माध्यम से गुजर broadens, इस विशेष संग्रह योजना के कम पारंपरिक मंदिर से inelastically बिखर इलेक्ट्रॉनों के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, वहाँ स्टेम में कोई लेंस के बाद नमूना है, जिससे रंगीन aberrations कि मंदिर में हो सकता है परहेज है। कैमरा लंबाई समायोजित किया जा सकता है ताकि बीएफ डिटेक्टर मुख्य रूप से unscattered इलेक्ट्रॉनों का पता लगाता है। मोटी नमूने का अध्ययन करने के DF डिटेक्टर का उपयोग कर एकाधिक बिखरने, जो गलत छवियों का उत्पादन की वजह से सिफारिश नहीं है। इसके बजाय, बीएफ डिटेक्टर 11 का इस्तेमाल किया जा सकता है। स्टेम उच्च SNR छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, यह अपेक्षाकृत उच्च बीम अभिसरण मंदिर की तुलना की वजह से एक अपेक्षाकृत कम गहराई का क्षेत्र है, में गहराई से जानकारी की मात्रा है कि मोटी से बरामद किया जा सकता को कमनमूनों। विपथन को सही स्टेम सूक्ष्मदर्शी, जहां अभिसरण कोण 30 mrad के रूप में उच्च हो सकता है के मामले में, गहराई का क्षेत्र काफी कम हो सकता है इतना है कि जानकारी के ध्यान में है कि केवल कुछ नैनोमीटर के एक फोकल हवाई जहाज़ से निकलती है । समानांतर मोड में इलेक्ट्रॉन बीम की स्थापना गहराई के क्षेत्र इलेक्ट्रॉन बीम का संकल्प 12 की हानि के लिए बढ़ाता है। हालांकि, इस सेटअप हमेशा संभव नहीं है। जब भी यह एक अभिसरण इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, एक तकनीक है कि गहराई के क्षेत्र इलेक्ट्रॉन बीम के बढ़ाने जब मोटी नमूने का अध्ययन कर उपयोग करना चाहिए। हाल के अध्ययनों में फोकस जानकारी 13, 14 की अधिकतम राशि की वसूली के लिए नमूना भर में विभिन्न फोकल विमानों में एकाधिक छवियों के अधिग्रहण की सूचना है। दो अध्ययनों विभिन्न फोकल विमानों से जानकारी को संभालने के लिए अलग अलग तरीकों का वर्णन है। Hovden एट अल।फूरियर अंतरिक्ष में संयुक्त छवियों कि विभिन्न फोकल विमानों पर एकत्र किए गए थे, और अंतिम पुनर्निर्माण बदलना 13 3 डी उलटा फूरियर से सीधे प्राप्त हुई थी। इसके विपरीत, Dahmen एट अल। असली अंतरिक्ष में विभिन्न फोकल विमानों 14 से 3 डी की मात्रा को फिर से संगठित करने के लिए एक अभिसरण किरण पुनर्निर्माण इंजन विकसित किया है। हमारी प्रयोगशाला भी इमेजिंग मोटी जैविक नमूनों के लिए एक विधि विकसित की है। हमारी रणनीति है कि ऊपर वर्णित दो तरीकों से अलग हम जानकारी विभिन्न फोकल विमानों में ध्यान में है कि विलय कर दिया और एक समानांतर बीम प्रोजेक्टर 15 का उपयोग वास्तविक अंतरिक्ष में अंतिम 3 डी की मात्रा को खंगाला था। हमारा उद्देश्य एक तरीका है कि आसानी से किसी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगशाला में किया जा सकता है विकसित करने के लिए किया गया था। यह अंत करने के लिए, हम समय की एक सीमित मात्रा में है, पारंपरिक टोमोग्राफी प्रयोगों की समय सीमा के लिए तुलनीय में फोकल छवियों को इकट्ठा करने के उद्देश्य से। इसके अलावा, हमारे प्रस्तावित विधि गसंरेखण और पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के विभिन्न प्रकार के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा ould। 2015 में 15 से हमारे प्रकाशन के संदर्भ में, हम कल्पना और गहराई के क्षेत्र की वसूली के लिए चिह्नित करना चाहता था, इसलिए हम 25 mrad की एक बड़ी अभिसरण अर्द्ध कोण इस्तेमाल किया। यहाँ, हम विधि 2015 15 में हमारी प्रयोगशाला में विकसित के अनुसार स्टेम के माध्यम से फोकल इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल मौजूद है, और हम वर्तमान कैसे 2015 से डेटा संसाधित किया गया था। इस विधि को एक मोटी (750 एनएम) जैविक नमूने भर में कई फोकल विमानों से फोकस जानकारी ठीक नहीं है और उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी पुनर्निर्माण सक्षम बनाता है। जहां प्रासंगिक, इस पद्धति अन्य समूहों द्वारा इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में मतभेद भी प्रस्तुत कर रहे हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &#176;C. 
			Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin Capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triming and Histo knives</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>Diatome diamond knives</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy copper grid</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Coating Pen</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>70624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Holder</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EM-21311 HTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

हमारे अध्ययन में, इलेक्ट्रॉनों क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में 200 केवी करने के लिए त्वरित किया गया। छवियाँ 20 μs ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग स्टेम बीएफ मोड म?...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

तैयारी और मोटी जैविक नमूने का अवलोकन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी ट्रांसमिशन द्वारा

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

The overall goal of this procedure is to obtain a three-dimensional reconstruction with depth of field recovery of a thick biological specimen using convergent beam scanning transmission electron tomography. This method can answer key questions in the field of structural biology about electron tomography of thick biological specimens. The main advantage of this technique is that images can be acquired in convergent bit mode and the data processing can be performed on most software dedicated to tomography.To begin preparing cell culture sample, centrifuge the sample at 5000 x g for five minutes. Use these centrifugation parameters throughout sample preparation. Discard the supernatant and resuspend the cells in one milliliter of PBS enriched with 4%paraformaldehyde and 2%gluteraldehyde.Incubate the suspension for 30 minutes at room temperature. Centrifuge the mixture, discard the supernatant, and wash the pellet three times with one milliliter portions of PBS. Using the same incubation conditions and washing procedure, incubate the pellet in one milliliter of PBS, enriched with 1%osmium tetroxide, and in one milliliter of PBS enriched with 2%uranyl acetate.Next, cool the sample to four degrees Celsius. Dehydrate the pellet by successive incubations in increasingly concentrated ethanol solutions. Maintaining the sample temperature of four degrees Celsius throughout incubation, centrifugation, and washing.Resuspend the dehydrated pellet in one milliliter of pure ethanol, and incubate overnight at 4 degrees Celsius. Then, allow the sample to warm to room temperature, and centrifuge the sample. Incubate the pellet in increasingly concentrated epoxy resin solutions at room temperature.After the final wash, resuspend the pellet in one milliliter of pure epoxy resin, and incubate overnight at room temperature. Centrifuge the sample, and remove the supernatant, and then resuspend the pellet in 200 microliters of epoxy resin and hardener. Transfer the suspension into the capsule.Incubate the plastic capsule at 60 degrees Celsius for 48 hours to polymerize the resin. Remove the capsule from the incubator and verify resin polymerization. Add a layer of epoxy resin and hardener over the embedded sample and incubate the capsule again under the same conditions.Mount the sample embedded in resin upside down in a specimen holder. Securely fix the sample on the trimming block of an ultramicrotome. Cut the plastic capsule away from the sample in the resin.Shape the exposed resin into a pyramid. Then transfer the capsule and specimen holder to the moving arm of the ultramicrotome. Install a trimming knife and guided by a microscope, refine the pyramid shape.Replace the trimming knife with a histology knife. Under the microscope, adjust the capsule pitch angle so the pyramid is perpendicular to the knife edge. Set the cutting speed and section the sample.After sectioning the sample, transfer the chosen section to a treated copper grid over filter paper. Allow the sample to dry, and then load the sample into the electron microscope. To design the through focal tilt series, first calculate the electron beam depth of field and the maximal apparent thickness of the sample.Based on these values, select a focus interval and determine the number of focal steps needed to image the entire sample at the maximal apparent thickness. Then, at low magnification, locate the region of interest within the sample. Adjust the eucentric height so that the ROI does not appear to move when the sample is rotated.Verify that the ROI remains visible throughout the tilt range. Fill in the through focal tilt series parameters for automated image collection and acquire the images. Import the image series into an image processing program, and align the images collected at the same tilt angle in a pyramidal hierarchy.Find the alignment at each tilt angle by stacking the aligned images. Browse through the stack to ensure that only the focused region moves from image to image and realign the images as needed. Once alignment is verified throughout the sample, merge the in-focus information at the high settings to yield the series with a single image per tilt angle.Perform find alignment of the tilt series based on local minima or fiducial markers. Perform a 3-D reconstruction and inspect the resulting image. If the reconstruction appears blurred or deformed, realign the original image series.A sample of t. brucei was imaged and analyzed using this method. At a zero degree tilt angle, several details of the flagellar pocket are visible.At the higher tilt angle of 70 degrees, only a portion of each image collected in the through focal series is in focus. This position shifts throughout the series. By merging the in-focus sections, a single image with a larger in-focus zone is produced.This effect is even more pronounced when the high frequency areas of the through focal tilt series are highlighted. The high frequency information spans most of the combined image, indicating that the through focal tilt series has been processed well. Once mastered, the image processing part can be done in around three to four hours, depending on the chosen alignment and reconstruction parameters.While attempting this procedure, it's important to remember that the quality of the final reconstruction greatly depends on the quality of the previous alignments tests. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform the collection and the image processing of a through focal tilt series.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी द्वारा mitochondria में एटीपी synthase dimers के दृश्य

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

पूरा पर्वत से zebrafish भ्रूण नमूने सना का अवलोकन और विश्लेषण के लिए फ्लैट माउंट तैयारी<em&gt; सीटू</em&gt; संकरण

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

क्रायो स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा रुक-खंडित पत्ता ऊतकों के भीतर संश्लेषक झिल्ली के Supramolecular संगठन का अध्ययन

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

समस्याग्रस्त प्लांट, Oomycete, और फफूंद नमूने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) प्रोटोकॉल स्कैन

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosomes की नमूना तैयारी और इमेजिंग

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा Cyanobacteria में डीएनए संपीड़न के दृश्य

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए लघुकृत नमूना तैयारी

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

उच्च दबाव ठंड, माइक्रोवेव की सहायता के विपरीत वृद्धि, और मात्रा इमेजिंग के लिए ंयूनतम राल Embedding द्वारा जैविक नमूना तैयारी

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वॉल्यूम जानकारी के लक्षित अधिग्रहण के लिए सरणी टोमोग्राफी वर्कफ़्लो

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

जैविक ऊतक नमूनों के सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...