Name: human lung dendritic cells: spatial distribution and phenotypic identification in endobronchial biopsies using immunohistochemistry and flow cytometry
Uploaded: 2017-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry at JoVE

Die Autoren möchten die Freiwilligen danken, die klinische Material zu dieser Studie beigetragen haben. Wir sind auch dankbar, dass die Mitarbeiter an der Abteilung für öffentliche Gesundheit und klinische Medizin, Abteilung für Medizin / Pneumologie, Universitätsklinikum, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) für die Sammlung aller klinischen Materials. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an AS-S von der schwedischen Research Council, die schwedische Herz-Lungen-Stiftung, der schwedischen Stiftung für strategische Forschung und dem Karolinska Institutet unterstützt.

HINWEIS: Diese Arbeit wurde von der regionalen Ethical Review Board in Umeå, Schweden genehmigt wurde. 1. Bronchoskopie zur Probenahme Endobronchial Biopsien von Human Subjects <ol><li> Erhalten Sie informierte Zustimmung aller Beteiligten. </li><li> Behandeln Sie Patienten mit oralem Midazolam (4-8 mg) und intravenöse Glycopyrroniums (0,2-04 mg) 30 Minuten vor der Bronchoskopie. Bewerben Lokalanästhesie mit Lidocain in den Larynx und der Bronchien. Lassen Sie das Thema Gurgeln mit ~ 3 ...

<ol>
	<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+dendritic+cells+at+the+innate-adaptive+immune+interface.">Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface.</a> J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).</li><li>Lambrecht, B. 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Dieses Dokument beschreibt, wie eine detaillierte räumliche und phänotypischen Charakterisierung von Lungengewebe residenten DCs bei gesunden Menschen zu erzeugen, Immunhistochemie und Zytometrie auf endobronchiale Schleimhaut-Biopsien während der Bronchoskopie gesammelt fließen. In den folgenden Absätzen kritischen Schritte in dem Protokoll werden im Detail diskutiert. Kritische Schritte mit dem Protokoll Schneiden und Immunhistochemie: Es ist wichtig, die Bio...

Die Lungen sind in ständigem Kontakt mit der äußeren Umgebung und sind an beiden unschädliche Teilchen und Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Krankheit zu verursachen stark ausgesetzt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Immunsystem wirksamer Immunreaktionen gegen eindringende Pathogene zu montieren, aber es ist ebenso wichtig, Toleranz gegenüber inhalierten Antigenen zu erhalten, die nicht Krankheit verursachen kann. Bereitzustellen potent Immunüberwachung wird das Atmungssystem mit einem Netzwerk von Immunzellen ausgekleidet, einschließlich dendritischen Zellen (DCs). DCs sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die mit der einzigartigen Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren. In menschlichen Lungen auftreten resident DCs ein Antigen und dann verarbeiten und transportieren sie in die Lunge-drainierenden Lymphknoten zur Präsentation an und Aktivierung von T - Zellen 1, 2, 3. Im menschlichen Immunsystem kann DCs in mehrere Untergruppen unterteilt werden, mit Distinct aber überlappende Funktionen: CD1c + und CD141 + myeloider DCs (MDC) und CD123 + plasmazytoiden DCs (PDCs) 4, 5. Während die meisten detailliertes Wissen über die menschliche DCs aus Studien in Blut stammt, ist nun klar , dass die menschliche Lunge 9 auch seltene Populationen von DC Untergruppen mit T-Zell - stimulierende Kapazität 6, 7, 8, Hafen. Allerdings zeigen anfallenden Daten , dass Immunzellen, einschließlich DCs, unterscheiden sich in ihrer Frequenz, Phänotyp und Funktion in Abhängigkeit von ihrer anatomischen Lage 10. Somit ist es wichtig, Immunzellen aus dem relevanten Gewebe zu studieren ihren Beitrag zur lokalen Immunität und Toleranz zu verstehen. Zusammengenommen unterstreicht dies die Notwendigkeit, Lungenresidenten DCs zu studieren, wenn Lungenerkrankungen Adressierung trotz Blut DCs mehr ist leicht verfügbar und zugänglich<html> in Menschen. Die ersten Studien , die Lungenresidenten DCs beim Menschen in erster Linie untersucht verließ sich auf die Morphologie und die Expression einzelner Marker, wie HLA-DR und CD11c, in Gewebeschnitten mittels Immunhistochemie 11, 12, 13. Im Gegensatz dazu haben neuere Studien der Regel auf durchflusszytometrischen verlassen analysiert verschiedene Immunzelluntergruppen zu untersuchen. Da es jedoch schwierig ist, einen einzelnen Zelloberflächenmarker zu finden, die eindeutig einen bestimmten DC Subset identifiziert, ist die potentielle Begrenzung der Studien Anwendung nur Vierfarben-Durchflusszytometrie das Risiko Zellpopulationen mit ähnlichen phänotypischen Marker wie DCs von einschließlich. Zum Beispiel CD11c wird auf allen myeloiden DCs und die überwiegende Mehrzahl der Monozyten exprimiert. Auf der anderen Seite, in Studien fortgeschritteneren Durchflusszytometrie Platten, nicht-kanzerösen Lungengewebe von chirurgische Resektionen von Patienten Anwendung wurden typischerweise verwendet,xref &quot;&gt; 10, 14, 15, 16, obwohl es ist unklar , ob diese seltenen Populationen von DCs in gesunden Probanden wirklich repräsentativ sind. Insgesamt sind im Wesentlichen auf die Tatsache Studien begrenzt , dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp. Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, beschreibt diese Arbeit, wie eine detaillierte Analyse der räumlichen Verteilung und einer phänotypischen Identifizierung von DCs in der Schleimhaut endobronchiale Biopsien von gesunden Freiwilligen erhalten auszuführen, die eine Bronchoskopie unterziehen. Mehrere kleine Biopsien können von jedem einzelnen gesammelt werden und anschließend eingebettet werden kann für das Schneiden und Analyse Immunhistochemie oder enzymatisch für fortgeschrittene durchflusszytometrische Analyse verdaut. Verwendung von Lungengewebe in Form von endobronchialen Biopsien von Bronchoskopie erhalten verleiht den Vorteil, dass es möglich, die st auszuführenudy an gesunden Freiwilligen, im Gegensatz zu einer offenen Operation der Lunge, die aus offensichtlichen Gründen ist, beschränkt sich auf Patienten, die Thoraxchirurgie erfordern. Weiterhin das Gewebe, das während einer Bronchoskopie von gesunden Freiwilligen abgetastet ist physiologisch normal, im Gegensatz zu einem nicht-betroffenen Bereich von Lungengewebe bei Patienten mit einer Lungenkrankheit. Auf der anderen Seite sind die Biopsien klein und die Anzahl der Zellen wiedergewonnen, selbst wenn mehrere Biopsien Bündelung begrenzt den Typ von Analyse, die durchgeführt werden können. Während die vorliegende Arbeit auf DCs konzentriert sich die beschriebenen Methoden direkt erweitert werden kann, um andere (Immun-) Zellen von Interesse, die in der menschlichen Schleimhaut Lungengewebe befinden umfassen. Darüber hinaus sind die Protokolle auch direkt anwendbar auf Proben von Patienten erhalten von Lungenerkrankungen leiden, wo Bronchoskopie Teil der Feststellung der Diagnose, wie zB chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Sarkoidose oder Lungenkrebs ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1260">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bronchoscopy</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:628px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bronchoscope BF1T160</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">BF1T160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light source&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">Exera CV-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Fenestrated forceps</td>
			<td style="width:172px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;">FB21C</td>
			<td>Used to take biopsies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bite Block</td>
			<td style="width:172px;">Conmed</td>
			<td style="width:148px;">1429</td>
			<td>20x27mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glucose 25%&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>500mL intravenous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Can be used for extra relaxation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine, 40mg/mL</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Mouth and throat administration / Gargled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine 100mg/ml spray</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Administered to back of throat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lidocaine 20mg/ml spray</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Administered via bronchoscope to airways</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA processing and embedding</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass vials</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Acetone</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">32201-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Molecular sieves, 4A</td>
			<td style="width:172px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:148px;">88120</td>
			<td>3-4mm diameter pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">P-7626</td>
			<td>0.035g/100ml acetone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">I-6125</td>
			<td>0.37g/100ml acetone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polythene-flat&#160; TAAB embedding capsules</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C094</td>
			<td>x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Capsule holder</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C054</td>
			<td style="width:628px;">Holds 25 8mm capsules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">JB-4 GMA embedding kit</td>
			<td style="width:172px;">Polysciences</td>
			<td style="width:148px;">00226</td>
			<td>Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Methyl benzoate</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">27614-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Silica gel with humidity indicator</td>
			<td style="width:172px;">Scharlau</td>
			<td style="width:148px;">GE0043</td>
			<td>2.5-6mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:172px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:148px;">10143562CEF</td>
			<td>Cut edges, frosted end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Poly-L-Lysine solution</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">P8920-500mL</td>
			<td>1:10 for working solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheet glass strips for ultramicrotomy</td>
			<td>Alkar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Wash solution (0.1% Tween20)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LKB 7800B Knifemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Capsule splitter</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">C065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Carbon steel single edge blades</td>
			<td style="width:172px;">TAAB laboratories</td>
			<td style="width:148px;">B054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Vice</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ammonia, 25%</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">1133.1000</td>
			<td>2mL in 1L, 1:500 (0.05%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microtome</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica RM 2165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light source</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica CLS 150 XE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microscope with swing arm stand</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica MZ6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GMA Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Diamond tipped pen</td>
			<td style="width:172px;">Histolab</td>
			<td style="width:148px;">5218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td style="width:172px;">AnalaR Normapur</td>
			<td style="width:148px;">23619.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>82-045-2</td>
			<td>Probumin BSA diagnostic grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human CD45 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304002</td>
			<td>Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human CD1a antibody</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA80GA</td>
			<td>Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse monoclonal IgG1 isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse monoclonal IgG2a isotype control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X094301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectastain ABC Elite standard kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite</td>
			<td style="width:172px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:148px;">SK-4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mayers haematoxylin</td>
			<td style="width:172px;">HistoLab</td>
			<td style="width:148px;">01820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Permanent Aqueous Mounting Medium</td>
			<td style="width:172px;">AbD Serotech</td>
			<td style="width:148px;">BUF058C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Drying oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DPX permanent mounting solution&#160;</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">360292F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica DMLB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Microscope camera</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica DFC 320</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Analysis software</td>
			<td style="width:172px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica Qwin V3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Enzymatic digestion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>55021C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DNase</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Forceps</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Platform rocker</td>
			<td style="width:172px;">Grant instruments</td>
			<td>PMR-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:172px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:172px;">Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Flow cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>555485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>557757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD20</td>
			<td>BD</td>
			<td>335829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD56</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD66abce</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-101-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HLA-DR</td>
			<td>BD</td>
			<td>555813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD14</td>
			<td>BD</td>
			<td>557831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>560369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD1c</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-098-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD141</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">LSR II Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Software for analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human lung dendritic cells: spatial distribution and phenotypic identification in endobronchial biopsies using immunohistochemistry and flow cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Studien an menschlichen Atmungsgewebe residenten Immunzellen zu charakterisieren, einschließlich DCs, sind begrenzt, vor allem aufgrund der Tatsache, dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp. Hier wird eine weniger invasive Methode der Lungengewebe von endobronchialen Biopsien erhalten (EBB) von gesunden Freiwilligen und entwickelten Protokolle, die Immunzellen in das Gewebe zu studieren Immunhistochemie unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder skizz...

Watch this Scientific Journal Video about Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry at JoVE

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Menschliche Lunge Dendritische Zellen: Räumliche Verteilung und phänotypische Identifizierung in Endobronchial Biopsien mittels Immunhistochemie und Durchflusszytometrie

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

The main advantage of this technique is that a lot of information can be generated from small tissues obtained during bronchoscopy.This method can help answer key questions in mucosal immunology, where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as COPD, sarcoidosis, or lung cancer.Visual demonstration of this procedure will enable individuals new to this method to recognize when enzymatic digestion is complete.Demonstrating this procedure, along with Faezzah Baharom, will be Greg Rankin, a postdoc from our collaborator's lab at Ume

Research

JoVE Journal

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

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Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

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Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

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In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...