Name: single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells
Uploaded: 2017-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

نود أن نعترف جنيفر بير وإينات سنير، وكذلك جامعة معهد ولاية ايوا لعلم الوراثة البشرية، لمساعدتهم في إعداد ومعالجة العينات.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) في جامعة نورث وسترن. 1. إعداد حلول للكهربية (4 ساعات) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 0.1٪ ديبك المعالجة H 2 O عن طريق إضا...

<ol>
	<li>Austin, C., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Cell+Fate+in+the+Vertebrate+Retina.">Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina.</a> Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neuronal+Organization+of+the+Retina.">The Neuronal Organization of the Retina.</a> Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).</li><li>Rodieck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The First Steps in Seeing. , (1998).</li><li>Chiu, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+at+whole+population+and+single+cell+levels+reveals+somatosensory+neuron+molecular+diversity.">Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity.</a> Elife. 3, e04660 (2014).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+types+and+states+with+single-cell+genomics.">Defining cell types and states with single-cell genomics.</a> Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-Positive+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells:+From+Form+to+Function.">Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).</li><li>Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+classes+of+mRNAs+that+are+targeted+to+neuronal+dendrites.">Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).</li><li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level.">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+midbrain+dopaminergic+neuron+diversity+by+single-cell+gene+expression+profiling.">Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling.</a> Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).</li><li>Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Single-Cell+Isolation.">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).</li><li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+in+vivo+analysis+(TIVA)+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue.">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li><li>Qiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+RNA-Seq:+Technical+feasibility+and+reproducibility.">Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.</a> Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).</li><li>Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grouping+and+classifying+electrophysiologically-defined+classes+of+neocortical+neurons+by+single+cell,+whole-genome+expression+profiling.">Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling.</a> Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).</li><li>Fuzik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+electrophysiological+recordings+with+single-cell+RNA-seq+data+identifies+neuronal+subtypes.">Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes.</a> Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells.">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Bistratified+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells+in+the+Mouse.">Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse.</a> J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cone+pathway+influence+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+subtypes.">Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes.</a> J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).</li><li>Clontech Laboratories I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina&#174; Sequencing. , (2013).</li><li>Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+RNA-Seq+libraries+for+next+generation+sequencing.">Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).</li><li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors:+Cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision.">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li><li>Schmidt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Melanopsin+in+Alpha+Retinal+Ganglion+Cells+and+Contrast+Detection.">A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection.</a> Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Types+of+Retinal+Ganglion+Cells:+Current+Status+and+Implications+for+Neuronal+Classification.">The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification.</a> Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).</li><li>Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Profiling+of+Developing+and+Mature+Retinal+Neurons.">Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e3824 (2012).</li><li>Trimarchi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Heterogeneity+of+Developing+Retinal+Ganglion+and+Amacrine+Cells+Revealed+through+Single+Cell+Gene+Expression+Profiling.">Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li></ol>

بروتوكولنا يوضح، من خلال دليل سريع وسهل الاستخدام، وسيلة لإعداد خلايا واحدة من الطبقات المورفولوجية المحددة للتسلسل ذات جودة عالية، مع إصابة ضئيلة للعينة. في المخطوطة الحالية، وتتميز الخلايا العصبية في شبكية العين حساس في جوهرها بشكل مورفولوجيا، معزولة، وعلى استع...

ويلاحظ التنوع العصبي في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي، وخاصة في شبكية العين الفقارية، الأنسجة المتخصصة للغاية تتكون من 1 الدبقية و 6 أنواع الخلايا العصبية التي تنشأ من عدد واحد من خلايا السلف الشبكية 1 ، 2 ، 3 . يمكن تصنيف العديد من الأنواع الفرعية من الخلايا وظيفيا، شكليا، وراثيا. الهدف من هذا البروتوكول هو لربط التباين الوراثي لأنواع الخلايا لخصائص وظيفية و / أو المورفولوجية يمكن التعرف عليها. وقد تم تحديد عدد من الجينات لتصنيف الخلايا، ولكن العديد من الأنواع الفرعية لا تزال تذهب غير معهود، لأنها تمثل جزءا صغيرا من مجموع السكان. وتحديد الجينات داخل هذه الأنواع الفرعية محددة تسمح لفهم أكبر للتنوع الخلايا العصبية داخل شبكية العين، ويمكن أيضا تسليط الضوء على تنويع الخلايا العصبية في مكان آخر. فورثرمور، دراسات خلية واحدة تسمح للكشف عن أنواع الخلايا الجديدة، والتي قد تم تجاهلها بسبب انخفاض تمثيلها بين مجموع السكان 4 ، 5 ، 6 ، 7 . واحدة من فوائد ترانسكريبتوميكس خلية واحدة هي أن علامات فريدة من نوعها أو مجموعات من علامات التي تحدد نوع فرعي الخلوية معينة يمكن اكتشافها. ويمكن بعد ذلك استخدامها للحصول على الوصول الجيني إلى هذا النوع من الخلايا لالتلاعب مختلفة. على سبيل المثال، نحن نستخدم هذا البروتوكول لتوصيف الجينات نوع معين من الخلايا من مجموعة فرعية من خلايا العقدة الشبكية التي تعبر عن ميلانوبسين فوتوبيغمينت. استخدام علامة الفلورسنت في ميلانوبسين معربا عن خلايا الشبكية العقدة تمكن دراسة هذه الخلايا، كما يتم تجميعها معا بسبب التعبير عن الجين المعروف. ومن المثير للاهتمام، هناك خمسة أنواع فرعية معروفة من هذه الخلية بوبولاتيون في شبكية العين الماوس 8 . وهكذا، من أجل عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا من كل نوع، استخدمنا تصنيفات المورفولوجية المنشأة ضمن نموذج المعدلة وراثيا لتحديد كل نوع فرعي قبل عزل الخلية. هذه التقنية تسمح لتوصيف الخلايا وكذلك لعزلتها مباشرة من شبكية العين، من دون الحاجة إلى تفكك الأنسجة، والتي قد تسبب استجابة الإجهاد داخل الخلايا والتلوث بسبب قطع التشعبات 9 . وقد ظهرت العديد من التقنيات الجديدة في السنوات القليلة الماضية مع استمرار تطور طريقة رنا-سيق. هذه الأدوات تسمح للحصول على أقصى قدر من اكتساب الخلايا وكفاءة أكبر من حيث التكلفة في حين تقترب من السؤال في متناول اليد 4 ، 7 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 . ومع ذلك، في حينوكانت هذه التقنيات ممتازة يخطو الحجارة، وهناك عدد من العقبات لا تزال تواجه أن هذا البروتوكول هو قادرة على معالجة. أولا، العديد من الإجراءات الحالية عزل الخلايا من الأنسجة فصل ومحاولة استخدام إما تحليل المكون الرئيسي أو التكتل الهرمي بعد مخصصة لتحديد تصنيف الخلية. الاعتماد على هذه الأدوات لتصنيف الأنواع الفرعية قد لا تنتج نتائج موثوقة وقد تجبر واحد على إيجاد طرق جديدة للتحقق من صحة هذه البيانات لربط علامة وراثية لنوع خلية وظيفية. شرط التفكك في بروتوكولات أخرى يمكن أن يؤدي في بعض الأحيان إلى تلف الأنسجة ويمكن أن يسبب قطع الخلايا العصبية إلى قطع، مما أدى إلى خسارة محتملة من مرنا. وعلاوة على ذلك، في الاستعدادات خلية فصلها، قد تبدأ ردود الإجهاد تؤثر على ترانسكريبتوميس من هذه الخلايا 14 . هذا البروتوكول يتغلب على هذه التحديات من خلال تحديد نوع خلية وظيفية قبل العزلة، ويحافظ على أفضل حثروة الخلايا عن طريق الحفاظ على أنسجة الشبكية سليمة. تم إدخال تقنية واحدة في عام 2014، وتتألف من تحليل في الجسم الحي من ترانسكريبتوم من الخلايا الحية 15 . في حين أن هذه التقنية تسمح لفحص ترانسكريبتوم مع الحد الأدنى من تعطيل الميكانيكية للأنسجة، فإنه يفتقر إلى القدرة على تصنيف أنواع محددة من الخلايا داخل الأنسجة قبل فحص ترانسكريبتوميس دون استخدام الماوس مراسل محدد جدا. بروتوكولنا لا يتطلب مراسل معين، ونحن الاستفادة من ملء الخلايا والفيزيولوجيا الكهربية لتوصيف الخلايا قبل عزلتها. قيود أخرى من هذا البروتوكول السابق هو أنه يتطلب الطول الموجي محددة لإثارة عنصر فوتواكتيفابل، في حين يسمح بروتوكول لدينا لاستخدام مراسل الفلورسنت وصبغ الفلورسنت، والتي هي متاحة بسهولة أو يمكن اختيارها من قبل كل مختبر على حدة. ومع ذلك، تزوجت مختبرات أخرى طريقتين من الكهرباءالفسيولوجيا و ترانسكريبتوميكس لدراسة التنوع الخلوي. وقد تم استخدام التسجيلات التصحيح المشبك لوصف وظيفة خلية قبل عزلتها على الخلايا العصبية فصل 16 ، وفي بعض الحالات، وقد سبقت استخدام تحليل ميكروأري 17 لهذه الدراسات. نفس المضاعفات التي واجهتها تلك النهج، لأنها تتطلب تفكك الأنسجة أو استخدام التكنولوجيا ميكروأري، والتي تعتمد على التهجين من العينات إلى تحقيقات المتاحة. وكان واحدا من أحدث التطورات تطوير البقعة-سيق، وهي تقنية تجمع بين استخدام التسجيلات المشبك التصحيح والتكنولوجيا رنا-سيق لفهم الخلايا من شرائح الدماغ كله 18 . في حين أن هذه التقنية له أوجه التشابه مع بروتوكول المعروضة هنا، فمن المهم مرة أخرى أن نلاحظ أن نهجنا يسمح للأنسجة لتبقى سليمة لصحة الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول ل أوبتيميزاتأيون من هذا التحالف، الذي يولد مكتبات ذات خلية واحدة عالية الجودة لاستخدام رنا-سيق للحصول على عمق قراءة عالية ورسم الخرائط التغطية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Ames&#39; Medium</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">A1420-10X1L</td>
			<td style="width:372px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-gluconate</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>PO178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS005273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hyaluronidase</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish (35mm diameter)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmologic scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-687-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Micropipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flexible tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCL lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1031576</td>
			<td>Lysis Buffer 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 ml PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30124359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl Alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt RNAClean XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>RNA magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MagnaBlot II Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8351</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml MCT Graduated Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Lysis Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5X Ultra Low First-Strand Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3&#39; SMART-Seq CDS Primer II A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primer II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SMART-Seq v4 Oligonucleotide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SMARTScribe Rverse Transcriptase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X SeqAmp PCR Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Primer II A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SeqAmp DNA Polymerase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030020</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>DNA magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HS Bioanalyzer Chips &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>For the calculation of sample concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Reagents for Tagmentation and Index Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TD Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tagmentation Mix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NT Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tagmentation Neutralizing Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NPM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>Indices for Tagmentation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N501</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>White 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N502</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>White 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N701</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Orange 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N702</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Orange 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiSeq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td>For completing sequencing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells

اكتشاف علامات نوع الخلية محددة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظيفة الخلوية وأصول التجانس الخلوي. مع دفعة مؤخرا لتحسين فهم التنوع العصبي، من المهم تحديد الجينات التي تعبر عن تعريف مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا. الشبكية بمثابة نموذج ممتاز لدراسة التنوع في الجهاز العصبي المركزي، لأنها تتكون من عدة أنواع الخلايا الرئيسية. وقد أسفرت دراسة كل فئة رئيسية من الخلايا علامات الوراثية التي تسهل تحديد هذه المجموعات السكانية. ومع ذلك، توجد أنواع فرعية متعددة من الخلايا داخل كل من هذه الطبقات الخلايا الشبكية الرئيسية، وعدد قليل من هذه الأنواع الفرعية لها علامات وراثية معروفة، على الرغم من أن العديد قد تميزت مورفولوجيا أو وظيفة. ومن شأن معرفة العلامات الجينية لأنواع الشبكية الفردية أن تسمح بدراسة ورسم خرائط لأهداف الدماغ المتعلقة بوظائف بصرية محددة، كما يمكن أن تقدم نظرة ثاقبة على شبكات الجينات التيالحفاظ على التنوع الخلوي. الطرق الحالية المستخدمة لتحديد علامات وراثية من الأنواع الفرعية تمتلك عيوب، مثل تصنيف أنواع الخلايا التالية التسلسل. هذا يمثل تحديا لتحليل البيانات ويتطلب أساليب التحقق من صحة صارمة لضمان أن مجموعات تحتوي على خلايا من نفس الوظيفة. نقترح تقنية لتحديد مورفولوجيا ووظائف الخلية قبل العزلة والتسلسل، والتي سوف تسمح لتسهيل تحديد علامات النوع الفرعي. ويمكن أن تمتد هذه التقنية إلى أنواع الخلايا غير العصبية، فضلا عن السكان النادرة من الخلايا مع اختلافات طفيفة. هذا البروتوكول يعطي بيانات ذات نوعية ممتازة، كما قدمت العديد من المكتبات أعماق قراءة أكبر من 20 مليون يقرأ للخلايا واحدة. هذه المنهجية يتغلب على العديد من العقبات التي تقدمها خلية واحدة رنا-سيق وقد تكون مناسبة للباحثين تهدف إلى تعريف أنواع الخلايا بطريقة واضحة وفعالة للغاية.

يتم تصنيف أنواع الخلايا بسهولة بعد حقن الصبغة ويبين الشكل 1 مثالا على غفب + رغك قبل وبعد الفلورسنت التتبع ملء. تم تحديد هذه الخلية على أساس التعبير عن غفب في خط المعدلة وراثيا ( الشكل ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

هنا، نقدم نهج كومبيناتوريال لتصنيف أنواع الخلايا العصبية قبل العزلة ولتوصيف لاحقة من ترانسكريبتومس أحادية الخلية. هذا البروتوكول يحسن إعداد عينات لنجاح تسلسل الحمض النووي الريبي (رنا-سيق) ويصف منهجية مصممة خصيصا لتعزيز فهم التنوع الخلوي.

خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

وسحق العصب البصري النموذجي إصابة الفئران لدراسة الخلايا الشبكية بقاء العقدة

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

تتبع الفيروسية من الدوائر العصبية تعريف وراثيا

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

التصوير المقطعي التماسك البصري: التصوير الماوس العقدة الشبكية خلايا في فيفو

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

ترانسيكتيون جزئي في العصب البصري في الفئران: نموذج المنشأة مع نهج منطوق جديد لتقييم ثانوي ضمور خلايا الشبكية العقدة

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...