Name: single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells
Uploaded: 2017-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Jennifer Bair og Einat Snir, såvel som University of Iowa Institute for Human Genetics, for deres hjælp til at forberede og håndtere prøver.

Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Northwestern University. 1. Fremstilling af opløsninger til elektrofysiologi (4 timer) <ol><li> Lav 0,1% DEPC-behandlet H20 ved tilsætning af 1 ml diethylpyrocarbonat (DEPC) til 999 ml omvendt osmose-oprenset H20. Bland grundigt og lad blandingen inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (RT). Autoklaver derefter DEPC-blandet H20 i 15 minutter på en flydende cyklus. Lad den DEPC-behandlede H 2</sub...

<ol>
	<li>Austin, C., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Cell+Fate+in+the+Vertebrate+Retina.">Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina.</a> Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neuronal+Organization+of+the+Retina.">The Neuronal Organization of the Retina.</a> Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).</li><li>Rodieck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The First Steps in Seeing. , (1998).</li><li>Chiu, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+at+whole+population+and+single+cell+levels+reveals+somatosensory+neuron+molecular+diversity.">Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity.</a> Elife. 3, e04660 (2014).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+types+and+states+with+single-cell+genomics.">Defining cell types and states with single-cell genomics.</a> Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-Positive+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells:+From+Form+to+Function.">Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).</li><li>Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+classes+of+mRNAs+that+are+targeted+to+neuronal+dendrites.">Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).</li><li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level.">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+midbrain+dopaminergic+neuron+diversity+by+single-cell+gene+expression+profiling.">Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling.</a> Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).</li><li>Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Single-Cell+Isolation.">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).</li><li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+in+vivo+analysis+(TIVA)+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue.">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li><li>Qiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+RNA-Seq:+Technical+feasibility+and+reproducibility.">Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.</a> Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).</li><li>Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grouping+and+classifying+electrophysiologically-defined+classes+of+neocortical+neurons+by+single+cell,+whole-genome+expression+profiling.">Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling.</a> Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).</li><li>Fuzik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+electrophysiological+recordings+with+single-cell+RNA-seq+data+identifies+neuronal+subtypes.">Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes.</a> Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells.">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Bistratified+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells+in+the+Mouse.">Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse.</a> J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cone+pathway+influence+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+subtypes.">Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes.</a> J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).</li><li>Clontech Laboratories I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina&#174; Sequencing. , (2013).</li><li>Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+RNA-Seq+libraries+for+next+generation+sequencing.">Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).</li><li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors:+Cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision.">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li><li>Schmidt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Melanopsin+in+Alpha+Retinal+Ganglion+Cells+and+Contrast+Detection.">A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection.</a> Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Types+of+Retinal+Ganglion+Cells:+Current+Status+and+Implications+for+Neuronal+Classification.">The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification.</a> Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).</li><li>Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Profiling+of+Developing+and+Mature+Retinal+Neurons.">Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e3824 (2012).</li><li>Trimarchi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Heterogeneity+of+Developing+Retinal+Ganglion+and+Amacrine+Cells+Revealed+through+Single+Cell+Gene+Expression+Profiling.">Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li></ol>

Vores protokol viser ved hjælp af en hurtig og nem at bruge vejledning en metode til at forberede enkeltceller af identificerede morfologiske klasser til højkvalitets sekventering med lidt beskadigelse af prøven. I det nuværende manuskript er iboende lysfølsomme retinale ganglionceller morphologisk karakteriseret, isoleret og fremstillet for RNA-Seq. Cellulære påvirkninger kan forekomme under retinal håndtering; Af denne grund udskifter vi hvert stykke væv efter højst 4 timers brug. Vi kan vurdere tilstanden a...

Neuronal mangfoldighed observeres i hele centralnervesystemet, især i hvirveldyrets retina, et højt specialiseret væv bestående af 1 glial og 6 neuronale celletyper, der opstår fra en population af retinale stamceller 1 , 2 , 3 . Mange subtypes af celler kan klassificeres funktionelt, morfologisk og genetisk. Formålet med denne protokol er at binde celletypens genetiske variabilitet til deres identificerbare funktionelle og / eller morfologiske egenskaber. En række gener er blevet identificeret til klassificering af celler, men mange subtyper fortsætter med at gå ukarakteriseret, da de repræsenterer en lille del af den samlede population. Identifikationen af ​​gener inden for disse specifikke subtyper vil muliggøre en større forståelse af neuronal mangfoldighed i nethinden og kan også kaste lys på diversificering af neurale celler andre steder. FuEndvidere tillader enkeltcelleundersøgelser at afdække nye celletyper, som måske er blevet overset på grund af deres lave repræsentation blandt den samlede befolkning 4 , 5 , 6 , 7 . En af fordelene ved single-cell transcriptomics er, at unikke markører eller kombinationer af markører, der definerer en bestemt cellulær subtype, kan opdages. Disse kan så bruges til at få genetisk adgang til den pågældende celletype til forskellige manipulationer. For eksempel bruger vi denne protokol til at karakterisere de celletypespecifikke gener af en delmængde af retinale ganglionceller, der udtrykker photopigment melanopsin. Brugen af ​​en fluorescerende markør i melanopsin-ekspressionende retinale ganglionceller muliggør undersøgelsen af ​​disse celler, da de klynkes sammen på grund af deres ekspression af et kendt gen. Interessant er der fem kendte undertyper af denne celle popuLation i muslinien 8 . For at isolere RNA fra celler af hver type har vi således anvendt etablerede morfologiske klassifikationer inden for den transgene model for at identificere hver subtype forud for celleisolering. Denne teknik muliggør karakterisering af celler såvel som isolering direkte fra nethinden uden behov for vævsdissociation, hvilket kan forårsage stressrespons i celler og forurening på grund af afskårne dendritter 9 . Et væld af nye teknikker er kommet frem i de seneste år, da RNA-Seq-metoden fortsætter med at udvikle sig. Disse værktøjer giver mulighed for maksimeret celleopsamling og større omkostningseffektivitet, mens man nærmer sig spørgsmålet ved hånd 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Men mensDisse teknikker har været fremragende stepping stones, der er en række forhindringer stadig stødt på at denne protokol er i stand til at adressere. For det første isolerer mange af de nuværende procedurer celler fra dissocieret væv og forsøger at anvende enten hovedkomponentanalyse eller hierarkisk clustering post-hoc for at bestemme celleklassificering. At stole på disse værktøjer til at klassificere undertyper, kan ikke producere pålidelige resultater og kan tvinge en til at finde nye måder at validere disse data for korrelationen af ​​en genetisk markør til en funktionel celletype. Kravet om dissociation i andre protokoller kan undertiden resultere i vævsskade og kan forårsage at neuronale processer udskilles, hvilket resulterer i et potentielt tab af mRNA. Endvidere kan spændingsresponserne i dissocierede cellepræparater begynde at påvirke transkriptomerne af disse celler 14 . Denne protokol overvinder disse udfordringer ved at bestemme den funktionelle celletype forud for isolation, og det opretholder bedre hCellerne ved at holde retinalvævet intakt. En teknik blev introduceret i 2014 og bestod af in vivo analysen af ​​transkriptomet af levende celler 15 . Mens denne teknik muliggør undersøgelse af transkriptomet med minimal mekanisk forstyrrelse af vævet, mangler den evnen til at klassificere specifikke celletyper inden i vævet, inden de undersøger deres transkriptomer uden at anvende en meget specifik reportermus. Vores protokol kræver ikke en bestemt reporter, da vi udnytter cellepåfyldning og elektrofysiologi til at karakterisere celler før deres isolering. En anden begrænsning af denne tidligere protokol er, at det kræver en specifik bølgelængde til at excitere det fotoaktiverbare element, mens vores protokol tillader brugen af ​​en fluorescerende reporter og fluorescerende farve, som er let tilgængelige eller kan vælges af hvert laboratorium individuelt. Stadig har andre laboratorier giftet sig med to metoder for elektrOphysiologi og transcriptomics til undersøgelse af cellulær mangfoldighed. Anvendelsen af ​​patch-clamp-optagelser til at karakterisere funktionen af ​​en celle forud for dens isolering er blevet udført på dissocierede neuroner 16 og i nogle tilfælde har den forudgået anvendelsen af ​​mikroarrayanalyse 17 til disse undersøgelser. De samme komplikationer opstår ved disse fremgangsmåder, da de kræver vævsdissociation eller anvendelse af mikroarray-teknologi, som er afhængig af hybridisering af prøver til tilgængelige prober. Et af de seneste fremskridt har været udviklingen af ​​Patch-Seq, en teknik, der kombinerer brugen af ​​patch-clamp-optagelser og RNA-Seq-teknologi til at forstå celler fra helhjerteskiver 18 . Selvom denne teknik har sine ligheder med den her præsenterede protokol, er det igen vigtigt at bemærke, at vores tilgang gør det muligt for vævet at forblive intakt for cellernes helbred. Her præsenterer vi en protokol for optimizatIon af denne alliance, som genererer højkvalitets, enkeltcellebiblioteker til brug af RNA-Seq for at opnå en høj læstdybde og kortlægningsdækning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Ames&#39; Medium</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">A1420-10X1L</td>
			<td style="width:372px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-gluconate</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>PO178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS005273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hyaluronidase</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish (35mm diameter)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmologic scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-687-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Micropipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flexible tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCL lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1031576</td>
			<td>Lysis Buffer 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 ml PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30124359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl Alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt RNAClean XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>RNA magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MagnaBlot II Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8351</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml MCT Graduated Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Lysis Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5X Ultra Low First-Strand Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3&#39; SMART-Seq CDS Primer II A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primer II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SMART-Seq v4 Oligonucleotide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SMARTScribe Rverse Transcriptase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X SeqAmp PCR Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Primer II A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SeqAmp DNA Polymerase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030020</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>DNA magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HS Bioanalyzer Chips &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>For the calculation of sample concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Reagents for Tagmentation and Index Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TD Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tagmentation Mix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NT Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tagmentation Neutralizing Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NPM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>Indices for Tagmentation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N501</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>White 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N502</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>White 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N701</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Orange 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N702</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Orange 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiSeq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td>For completing sequencing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells

Opdagelsen af ​​celletypespecifikke markører kan give indsigt i cellulær funktion og oprindelsen af ​​cellulær heterogenitet. Med et nyligt skub for den forbedrede forståelse af neuronal mangfoldighed er det vigtigt at identificere gener, hvis udtryk definerer forskellige subpopulationer af celler. Nethinden tjener som en fremragende model til undersøgelsen af ​​mangfoldigheden i centralnervesystemet, da den består af flere hovedcelletyper. Undersøgelsen af ​​hver hovedklasse af celler har givet genetiske markører, som letter identifikationen af ​​disse populationer. Imidlertid findes der flere subtypes af celler inden for hver af disse større retinale celleklasser, og få af disse subtyper har kendt genetiske markører, selv om mange er blevet karakteriseret ved morfologi eller funktion. Kendskab til genetiske markører for individuelle retinale subtyper vil muliggøre undersøgelse og kortlægning af hjernemål rettet mod specifikke visuelle funktioner og kan også give indblik i gennetværketOpretholde cellulær mangfoldighed. Nuværende veje, der bruges til at identificere de genetiske markører for subtyper, har ulemper, såsom klassificering af celletyper efter sekventering. Dette giver en udfordring for dataanalyse og kræver strenge valideringsmetoder for at sikre, at klynger indeholder celler af samme funktion. Vi foreslår en teknik til identifikation af en celles morfologi og funktionalitet forud for isolering og sekventering, hvilket vil gøre det lettere at identificere subtypespecifikke markører. Denne teknik kan udvides til ikke-neuronale celletyper såvel som sjældne populationer af celler med mindre variationer. Denne protokol giver data af fremragende kvalitet, da mange af bibliotekerne har givet læse dybder større end 20 millioner læses for enkeltceller. Denne metode overvinder mange af de forhindringer, der præsenteres af single-cell RNA-Seq og kan være egnet til forskere, der sigter mod at profilere celletyper på en ligetil og meget effektiv måde.

Celletyper klassificeres let efter farvestofinjektionen Figur 1 viser et eksempel på en GFP + RGC før og efter fluorescerende sporingsfyldning. Denne celle blev identificeret baseret på dets ekspression af GFP i den transgene linje ( figur 1A ). En tæt forsegling blev dannet med en fin-spids, trukket glaselektrode på summen af ​​denne celle. For at karakterisere subtypen blev det fluores...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Her præsenterer vi en kombinatorisk tilgang til klassificering af neuronelle celletyper forud for isolation og til den efterfølgende karakterisering af enkeltcelletranscriptomer. Denne protokol optimerer forberedelsen af ​​prøver til vellykket RNA-sekventering (RNA-Seq) og beskriver en metodologi, der er designet specielt til forbedret forståelse af cellemangfoldighed.

Single-cell RNA-Seq af definerede subsæt af retinale Ganglion-celler

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Enkelt-celle Profilering af at udvikle og Ældre retinaneuroner

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Viral Sporing af genetisk Defineret neurale kredsløb

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Gennemførelse Dynamic Clamp med Synaptic og Artificial konduktanser i Mus retina-ganglieceller

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograd Mærkning af retina-ganglieceller i Voksen Zebrafisk med fluorescerende farvestoffer

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq analyse af differentiel genekspression i elektroporerede Chick embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk kohærens tomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Delvis synsnerven Transection i rotter: en standardformular, som udarbejdes med en ny operativ tilgang til at vurdere sekundære Degeneration af Retinal Ganglion celler

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...