Name: single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells
Uploaded: 2017-05-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Vi vil gjerne anerkjenne Jennifer Bair og Einat Snir, samt Universitetet i Iowa Institute for Human Genetics, for hjelp til å forberede og håndtere prøver.

Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Northwestern University. 1. Fremstilling av løsninger for elektrofysiologi (4 timer) <ol><li> Lag 0,1% DEPC-behandlet H20 ved å tilsette 1 ml dietylpyrokarbonat (DEPC) til 999 ml omvendt osmose-renset H20. Bland grundig og la blandingen inkuberes i 1 time ved romtemperatur. Deretter autoklaverer DEPC-blandet H20 i 15 minutter på en væskesyklus. La den DEPC-behandlede H 2 O avkjøles ved R...

<ol>
	<li>Austin, C., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Cell+Fate+in+the+Vertebrate+Retina.">Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina.</a> Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neuronal+Organization+of+the+Retina.">The Neuronal Organization of the Retina.</a> Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).</li><li>Rodieck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The First Steps in Seeing. , (1998).</li><li>Chiu, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+at+whole+population+and+single+cell+levels+reveals+somatosensory+neuron+molecular+diversity.">Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity.</a> Elife. 3, e04660 (2014).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+types+and+states+with+single-cell+genomics.">Defining cell types and states with single-cell genomics.</a> Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-Positive+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells:+From+Form+to+Function.">Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).</li><li>Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+classes+of+mRNAs+that+are+targeted+to+neuronal+dendrites.">Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).</li><li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level.">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+midbrain+dopaminergic+neuron+diversity+by+single-cell+gene+expression+profiling.">Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling.</a> Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).</li><li>Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Single-Cell+Isolation.">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).</li><li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+in+vivo+analysis+(TIVA)+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue.">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li><li>Qiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+RNA-Seq:+Technical+feasibility+and+reproducibility.">Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.</a> Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).</li><li>Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grouping+and+classifying+electrophysiologically-defined+classes+of+neocortical+neurons+by+single+cell,+whole-genome+expression+profiling.">Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling.</a> Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).</li><li>Fuzik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+electrophysiological+recordings+with+single-cell+RNA-seq+data+identifies+neuronal+subtypes.">Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes.</a> Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells.">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Bistratified+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells+in+the+Mouse.">Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse.</a> J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cone+pathway+influence+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+subtypes.">Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes.</a> J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).</li><li>Clontech Laboratories I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina&#174; Sequencing. , (2013).</li><li>Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+RNA-Seq+libraries+for+next+generation+sequencing.">Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).</li><li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors:+Cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision.">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li><li>Schmidt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Melanopsin+in+Alpha+Retinal+Ganglion+Cells+and+Contrast+Detection.">A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection.</a> Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Types+of+Retinal+Ganglion+Cells:+Current+Status+and+Implications+for+Neuronal+Classification.">The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification.</a> Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).</li><li>Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Profiling+of+Developing+and+Mature+Retinal+Neurons.">Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e3824 (2012).</li><li>Trimarchi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Heterogeneity+of+Developing+Retinal+Ganglion+and+Amacrine+Cells+Revealed+through+Single+Cell+Gene+Expression+Profiling.">Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li></ol>

Vår protokoll demonstrerer, gjennom en rask og brukervennlig guide, en metode for å forberede enkeltceller av identifiserte morfologiske klasser for kvalitetssekvensering, med liten skade på prøven. I det nåværende manuskriptet er iboende lysfølsomme retinale ganglionceller morfologisk karakterisert, isolert og fremstilt for RNA-Seq. Cellulære påkjenninger kan oppstå under retinalhåndtering; Av denne grunn erstatter vi hvert stykke vev etter ikke mer enn 4 timer bruk. Vi kan vurdere tilstanden til cellene ved...

Neuronal mangfold er observert gjennom sentralnervesystemet, spesielt i ryggradshinnen, et høyt spesialisert vev som består av 1 glial og 6 nevrale celletyper som oppstår fra en populasjon av retinale stamceller 1 , 2 , 3 . Mange subtyper av celler kan klassifiseres funksjonelt, morfologisk og genetisk. Målet med denne protokollen er å knytte den genetiske variabiliteten til celletyper til deres identifiserbare funksjonelle og / eller morfologiske egenskaper. En rekke gener er identifisert for klassifisering av celler, men mange subtyper fortsetter å gå ukarakterisert, da de representerer en liten del av den totale befolkningen. Identifikasjonen av gener innenfor disse spesifikke subtypene vil muliggjøre en større forståelse av neuronal mangfold i retina og kan også kaste lys over diversifiseringen av nevrale celler andre steder. FuVidere kan enkeltcellede studier muliggjøre avdekking av nye celletyper, som kanskje har blitt oversett på grunn av deres lave representasjon blant den samlede befolkningen 4 , 5 , 6 , 7 . En av fordelene ved enkeltcelletranscriptomikk er at unike markører eller kombinasjoner av markører som definerer en bestemt cellulær subtype, kan oppdages. Disse kan da brukes til å få genetisk tilgang til den celletypen for forskjellige manipulasjoner. For eksempel bruker vi denne protokollen til å karakterisere celletypespesifikke gener av en delmengde av retinale ganglionceller som uttrykker fotopigmentet melanopsin. Bruken av en fluorescerende markør i melanopsin-uttrykkende retinale ganglionceller gjør det mulig å studere disse cellene, da de blir klynget sammen på grunn av deres uttrykk for et kjent gen. Interessant er det fem kjente undertyper av denne cellen popuLation i muslinen 8 . For å isolere RNA fra celler av hver type har vi således brukt etablerte morfologiske klassifikasjoner innenfor den transgene modellen for å identifisere hver subtype før cellisolasjon. Denne teknikken tillater karakterisering av celler så vel som isolasjon direkte fra netthinnen, uten behov for vevsdissociasjon, noe som kan forårsake stressrespons i celler og forurensning på grunn av avskårne dendriter 9 . En rekke nye teknikker har kommet til lys de siste årene, ettersom RNA-Seq-metoden fortsetter å utvikle seg. Disse verktøyene tillater maksimert celleoppkjøp og større kostnadseffektivitet mens du nærmer deg spørsmålet ved hånden 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Imidlertid, mensDisse teknikkene har vært gode stepping stones, det er en rekke hindringer fortsatt oppdaget at denne protokollen er i stand til å adressere. Først isolerer mange av de nåværende prosedyrene celler fra dissociert vev og forsøker å bruke enten hovedkomponentanalyse eller hierarkisk clustering post-hoc for å bestemme celleklassifisering. Å stole på disse verktøyene for å klassifisere undertyper, kan ikke produsere pålitelige resultater og kan tvinge en til å finne nye måter å validere disse dataene for korrelasjonen av en genetisk markør til en funksjonell celletype. Kravet på dissosiasjon i andre protokoller kan noen ganger føre til vevskader og kan føre til at neuroneprosesser blir kuttet, noe som resulterer i et potensielt tap av mRNA. Videre kan i spredte cellepreparater begynne å påvirke transkriptomene av disse cellene 14 . Denne protokollen overvinter disse utfordringene ved å bestemme funksjonell celletype før isolasjon, og det opprettholder bedre hEalth av cellene ved å holde retinal vev intakt. En teknikk ble introdusert i 2014 og besto av in vivo analyse av transkriptomet av levende celler 15 . Mens denne teknikken tillater undersøkelse av transkriptomet med minimal mekanisk forstyrrelse av vevet, mangler det evnen til å klassifisere spesifikke celletyper i vevet før de undersøker transkriptomerene uten å bruke en meget spesifikk reportermus. Vår protokoll krever ikke en bestemt reporter, da vi bruker cellefylling og elektrofysiologi til å karakterisere celler før isolasjonen. En annen begrensning av denne tidligere protokollen er at den krever en bestemt bølgelengde for å spenne det fotoaktiverbare elementet, mens protokollen vår tillater bruk av en fluorescerende reporter og fluorescerende fargestoff, som er lett tilgjengelig eller kan velges av hver enkelt laboratorie individuelt. Likevel har andre laboratorier giftet seg med to metoder for elektrOphysiologi og transkriptomikk for studier av cellulær mangfold. Bruken av patch-clamp-opptak for å karakterisere funksjonen til en celle før isolasjonen, har blitt utført på dissocierte nevroner 16, og i noen tilfeller har den gått foran bruken av mikroarrayanalyse 17 for disse studiene. De samme komplikasjonene oppdages av disse tilnærmingene, da de krever vevsdissociasjon eller bruk av mikroarray-teknologi, som er avhengig av hybridisering av prøver til tilgjengelige prober. En av de siste fremskrittene har vært utviklingen av Patch-Seq, en teknikk som kombinerer bruken av patch-clamp-opptak og RNA-Seq-teknologi for å forstå celler fra helhjerneskiver 18 . Selv om denne teknikken har likheter med protokollen som presenteres her, er det igjen viktig å merke seg at vår tilnærming tillater at vevet forblir intakt for cellens helse. Her presenterer vi en protokoll for optimaliseringenIon av denne alliansen, som genererer høykvalitets, single-cell biblioteker for bruk av RNA-Seq for å oppnå en høy lese dybde og kartlegging dekning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Ames&#39; Medium</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">A1420-10X1L</td>
			<td style="width:372px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-gluconate</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>PO178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS005273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hyaluronidase</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish (35mm diameter)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ophthalmologic scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-687-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Micropipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flexible tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCL lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1031576</td>
			<td>Lysis Buffer 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 ml PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30124359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl Alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analog Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02215365</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt RNAClean XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63987</td>
			<td>RNA magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MagnaBlot II Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8351</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml MCT Graduated Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Lysis Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5X Ultra Low First-Strand Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3&#39; SMART-Seq CDS Primer II A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primer II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SMART-Seq v4 Oligonucleotide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SMARTScribe Rverse Transcriptase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2X SeqAmp PCR Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Primer II A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Primer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SeqAmp DNA Polymerase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mastercycler pro S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030020</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>DNA magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HS Bioanalyzer Chips &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>For the calculation of sample concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Reagents for Tagmentation and Index Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TD Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tagmentation Mix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NT Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tagmentation Neutralizing Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NPM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>Indices for Tagmentation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N501</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>White 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N502</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>White 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N701</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Orange 1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N702</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Orange 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiSeq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td>For completing sequencing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells

Oppdagelsen av celletypespesifikke markører kan gi innsikt i cellefunksjon og opprinnelsen til cellulær heterogenitet. Med en nylig press for forbedret forståelse av neuronal mangfold, er det viktig å identifisere gener hvis uttrykk definerer ulike subpopulasjoner av celler. Retina fungerer som en utmerket modell for studiet av sentralnervesystemdiversitet, da det består av flere store celletyper. Studien av hver hovedklasse av celler har gitt genetiske markører som letter identifiseringen av disse populasjonene. Imidlertid finnes det flere undertyper av celler innenfor hver av disse store retinale celleklasser, og få av disse subtypene har kjent genetiske markører, selv om mange har blitt preget av morfologi eller funksjon. Kunnskap om genetiske markører for individuelle retinale subtyper vil tillate studier og kartlegging av hjernemål rettet mot bestemte visuelle funksjoner og kan også gi innsikt i gennettene somOpprettholde mobilt mangfold. Nåværende veier som brukes til å identifisere de genetiske markørene til subtypene, har ulemper, for eksempel klassifisering av celletyper som følger sekvensering. Dette gir en utfordring for dataanalyse og krever strenge valideringsmetoder for å sikre at klynger inneholder celler med samme funksjon. Vi foreslår en teknikk for å identifisere morfologi og funksjonalitet av en celle før isolering og sekvensering, noe som vil tillate enklere identifisering av subtypespesifikke markører. Denne teknikken kan utvides til ikke-neuronale celletyper, så vel som sjeldne populasjoner av celler med mindre variasjoner. Denne protokollen gir data av utmerket kvalitet, ettersom mange av bibliotekene har gitt lese dybder større enn 20 millioner, leser for enkeltceller. Denne metoden overstyrer mange av hindrene presentert av single-cell RNA-Seq og kan være egnet for forskere som har som mål å profilere celletyper på en enkel og svært effektiv måte.

Celletyper klassifiseres lett etter fargestoffinjeksjonen Figur 1 viser et eksempel på en GFP + RGC før og etter fluorescerende sporingspåfylling. Denne cellen ble identifisert basert på dens ekspresjon av GFP i den transgene linjen ( Figur 1A ). En tett forsegling ble dannet med en finspiss, trukket glasselektrode på summen av denne cellen. For å karakterisere subtypen ble det fluoresceren...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Her presenterer vi en kombinatorisk tilnærming for klassifisering av nevrale celletyper før isolasjon og for den etterfølgende karakterisering av enkeltcelletransskriptomer. Denne protokollen optimaliserer utarbeidelsen av prøver for vellykket RNA-sekvensering (RNA-Seq) og beskriver en metodikk som er spesielt utviklet for å forbedre forståelsen av cellulært mangfold.

Enkeltcelle RNA-Seq av definerte subsets av retinal Ganglion-celler

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Encellet Profiling for å utvikle og modne Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Viral Sporing av genetisk Definert nevrale kretser

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementering Dynamic Clamp med Synaptic og kunstig conductances i mus retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograd Merking av retinal ganglion celler i voksen sebrafisk med fluorescerende fargestoffer

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse av Differential Gene Expression i elektroporerte Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence tomografi: Bildebehandling musen Retinal Ganglion celler i Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Delvis synsnerven Transection i rotter: modell etablert med en ny Operative tilnærming til vurdere sekundære degenerasjon av netthinnen ganglieceller

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...