Name: quantification of drosophila grooming behavior
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Drosophila Grooming Behavior at JoVE.com

Wir danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon und Rose Hedreen für die frühe Arbeit bei der Prüfung und Etablierung dieser Methodik und Kammermusik. Wir danken Kelly Tellez und Graham Buchan für das Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Wir danken Andrew Seeds und Julie Simpson für ihre Pionierarbeit und ihre Beratung und Unterstützung bei der Vorgabe der Verwendung von Brilliant Yellow Dye (Sigma). Diese Arbeit wird zum Teil von der Mary E. Groff Chirurgischen und medizinischen Forschung und Bildung Charitable Trust, dem Bronfman Science Center und dem Hellman Fellows Programm unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie einen Aspirator für das Bewegen von lebenden Drosophila aus einer Kulturfläschchen in die Putzkammer vor. Aspiratoren erlauben den Transfer von bewussten Tieren in die Verhaltenskammern, um sicherzustellen, dass die Anästhesie die nachfolgende Verhaltensbeobachtung nicht beeinträchtigt. <ol><li> Mit Schere schneiden 1.5 Meter von Tygon-Schlauch ID ⅛ &quot;, OD ¼&quot; .Schneiden Sie mindestens 1 Zoll von der Spitze einer 1 mL Einweg-Mikropipettensp...

<ol>
	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster.">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Organization+and+Postural+Facilitation+-+Rules+for+Grooming+in+Flies.">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951 (2014).</li><li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila.">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li><li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100 (2011).</li><li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders.">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine.">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li><li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila.">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li><li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMB,+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies.">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li><li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines.">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li><li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+D1+family+dopamine+receptor,+DopR,+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila.">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li><li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

Der Grooming-Assay ist relativ einfach, aber wir würden den Experimentatoren vorsichtig sein, den folgenden Problemen besondere Aufmerksamkeit zu widmen. Eine dichte Abdichtung durch Anziehen der Schrauben an der Ober- und Unterseite nach dem Einführen von Fliegen und Farbstoff ist für reproduzierbare Ergebnisse unerlässlich. Der brillante gelbe Farbstoff ist sehr fein und lose Gelenke werden Verluste an Farbstoff aus den Kanten der Kammer ermöglichen. Die Unregelmäßigkeit des Farbstoffgehalts für jede Vertiefun...

Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) ist ein robustes angeborenes Verhalten, das die Koordination mehrerer unabhängiger motorischer Programme beinhaltet 1 . Fruchtfliegen reinigen ihre Körper von Staub, Mikroben und anderen Krankheitserregern, die die normale physiologische Funktion wie Seh- und Flucht behindern oder zu erheblichen Immun-Herausforderungen führen können. Beim Erfassen und Beantworten sowohl der mechanischen 2 als auch der immunen Aktivierung 3 reiben Fliegen wiederholt ihre Beine zusammen oder auf eine gezielte Körperregion, bis sie ausreichend sauber ist und das Grooming zu einem anderen Teil des Körpers fortschreitet. Fliegen führen Putzbewegungen in deutlichen Kämpfen durch, die weitgehend in stereotypen Mustern 1 , 4 auftreten . Eine Verhaltenshierarchie wird deutlich, wenn Putzsignale priorisiert werden. Schaltungen und Wirkungsmuster wurden in der Unterstützung identifiziert oFa-Modell, dass Grooming-Programme an der Spitze der Hierarchie auftreten zuerst und unterdrücken parallele Signale aus Bereichen des Körpers, die nachher gepflegt werden 5 . Höchste Priorität wird dem Kopf gegeben, dann dem Bauch, den Flügeln und schließlich dem Thorax 5 . Das Grooming-Programm in D. melanogaster ist ein ideales System für das Studium von neuronalen Schaltungen, modulatorischen molekularen Signalen und Neurotransmittern. Zum Beispiel verursachen Kompromisse der Neurofibromin-Funktion 6 , der Verlust des Drosophila- zerbrechlichen X-mentalen Retardierungsproteins ( dfmr1 ) 7 und die Exposition gegenüber Bisphenol A (BPA) 8 alle ein übermäßiges Putzen und andere Verhaltensweisen, die analog zu diskreten menschlichen Symptomen der Neurofibromatose, zerbrechlichen X sind Syndrom und Aspekte von Autismus-Spektrum-Störungen und Attention-Deficit Hyperaktivitätsstörung (ADHS). Grooming Verhalten kann auch habitua seinTed unterschiedlich über Mutantenstämme 2 , die dieses Motorprogramm für Studien der Verhaltenskraft verleihen. Die Breite der neurologischen Phänomene, die von Drosophila modelliert werden kann, verlangt einen neuartigen Vergleichsansatz, um die Fähigkeit der Fliegen zu messen, sich selbst zu pflegen. Die kombinierte Wirkung von vesikulären Monoamin-Transportern und die relative Häufigkeit von Dopamin und anderen biogenen Aminen im Körper wurde gezeigt, um das Fruchtfliegen-Groomverhalten 9 , 10 zu vermitteln. Octopamin und Dopamin stimulieren vergleichbare Hindleg-Grooming-Aktivität in enthaupteten Fliegen, während Tyramin, der Vorläufer des Octopamins, auch das Grooming in geringerem Maße auslöst 7 . Vier Dopaminrezeptoren wurden in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 identifiziert </supAufgaben Durch die Verwendung des in diesem Protokoll beschriebenen Grooming-Assay-Verfahrens haben wir eine Rolle für die Typ-I-Familie Dopamin Rezeptor DopR ( DopR, dDA1, dumm ) im Hindleg- Grooming-Verhalten 15 . Grooming kann indirekt quantifiziert werden, indem man das Ausmaß der Sauberkeit betrachtet, mit dem ein Tier nach dem Abstauben des ganzen Körpers mit einem Markerfarbstoff oder einem fluoreszierenden Staub 5 , 16 vollständig pflegen kann. Der Rest des Staubes, der auf dem Körper verbleibt, kann als relativer Marker für das Gesamtverhalten verwendet werden. Staubige Fliegen, nachdem sie genügend Zeit zum Bräutigam gegeben haben, können ein spezifisches Defizit im Putzverhalten manifestieren. Da die Grooming-Untersuchungen umfangreicher geworden sind, haben Protokolle solche Praktiken als Enthauptung integriert, um pharmakologische Behandlungen auf die Nacken-Binde-Nerven 10 hinzuzufügen, taktile Stimulation von Borsten, um die Grooming-Antwort 2 hervorzurufen,Und Videoaufzeichnung des Verhaltens 15 . Die direkte Beobachtung der Pflege kann leicht durch die visuelle Beobachtung und manuelle Aufzeichnung der Häufigkeit und Dauer der spezifischen Grooming-Ereignisse 4 untersucht werden . Wir haben eine Fünfzehn-Brunnen-Grooming-Kammer entworfen, die mit einem 3D-Drucker oder einem Laser-Cutter konstruiert werden kann und die Blaupause-Designs zur Reproduktion zur Verfügung stehen 15 . Die Konstruktion verwendet zwei miteinander verbundene Mittelplatten mit Öffnungen, die durch Mesh und zwei zusätzliche Gleit- und Bodenplatten, von denen Fliegen und / oder Farbstoff beladen werden, abgetrennt und getrennt sind. Nachdem wir dem Staub gesträubt haben, legen wir sie in Ethanol ab, um den Farbstoff zu solubilisieren und die Absorption dieser Lösung bei der Wellenlänge des Farbstoffs zu messen. Ein Plattenleser kann für mehrere parallele Proben verwendet werden oder ein Einzellesenspektrophotometer kann für einzelne Proben verwendet werden. Diese Methode minimiert den durch Handhabung verursachten Fehler und alTiefs für Grooming-Assays, die auf einer kleineren, kostengünstigen Skala laufen. Dieses Verfahren wird abgeleitet und von den Methoden , die von Julie Simpson und Andrew Seeds Pionier modifiziert, die mit Heizelementen für temperaturempfindliche Schaltung Manipulationen 5 größere Grooming Kammern verwenden. Das folgende Protokoll zeigt die Quantifizierung des Groomens des ganzen Körpers sowie die alternativen Methoden zur Quantifizierung der Farbstoffansammlung an einzelnen Körperteilen. Wir zeigen auch Beispielvergleichsdaten zwischen WT- und DopR- Mutanten sowie Methoden zur Berechnung eines einfachen Leistungsindexes für das Groomverhalten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5229K54</td>
			<td>ID 1/8&#34;, OD 1/4&#34;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (1ml and 200ul)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-165, 24-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Screen, 2&#34; x 2.6&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9318T44</td>
			<td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Yellow Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201375-25G</td>
			<td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>set to &#34;touch&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>86-1282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10025-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20170-293</td>
			<td>tubes can be reused with successive assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>26014017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HTX Platereader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>need to download catalog to access product number</td>
			<td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; acrylic plastic</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8473K341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 nuts</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90257A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A199</td>
			<td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1/2&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A194</td>
			<td>the second plate from the top needs to be tapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-56 3/8&#34; flat head phillips machine screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91500A088</td>
			<td>these hold the two middle plates together</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.175&#34; ID, 1/4&#34; OD, 0.34&#34; aluminum pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92510A044</td>
			<td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&#160; These act as sheaths for the 1&#34; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of drosophila grooming behavior

Drosophila- Grooming-Verhalten ist ein komplexes, mehrstufiges Lokomotiv-Programm, das eine koordinierte Bewegung von Vorder- und Hinterbeinen erfordert. Hier stellen wir ein Grooming-Assay-Protokoll und ein neuartiges Kammerdesign vor, das kostengünstig und skalierbar ist für kleine oder große Studien der Drosophila- Pflege. Fliegen sind ganz über ihren Körper mit Brilliant Yellow Farbstoff und gegebene Zeit, um den Farbstoff aus ihren Körpern in der Kammer zu entfernen. Fliegen werden dann in einem eingestellten Volumen an Ethanol abgelagert, um den Farbstoff zu solubilisieren. Die relative spektrale Extinktion von Farbstoff-Ethanol-Proben für gepflegte und nicht geschliffene Tiere wird gemessen und aufgezeichnet. Das Protokoll liefert quantitative Daten der Farbstoffakkumulation für einzelne Fliegen, die leicht gemittelt und über Proben verglichen werden können. Dies ermöglicht es, dass experimentelle Entwürfe die Grooming-Fähigkeit für mutierte Tierversuche oder Schaltungsmanipulationen leicht auswerten können. Dieses effiziente Verfahren ist vielseitig und skalierbar. Wir zeigen wOrk-flow des Protokolls und Vergleichsdaten zwischen WT-Tieren und mutierten Tieren für den Drosophila Typ I Dopamin Rezeptor ( DopR ).

Der Grooming-Assay liefert quantitative Daten, um die Verhaltensfähigkeit zu bewerten, basierend auf dem relativen Rest des angesammelten Farbstoffs, der auf den Körper der Fliegen nach einer festgelegten Zeit der Messung für das Grooming (30 min) zurückgelassen wurde. Probenbilder der Gleitpflegekammergestaltung und Hauptschritte des Assays sind in Fig. 1 hervorgehoben . Fliegen aggregieren eine signifikante Menge an Farbstoff aus der sofortigen Staubbildung durch V...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Drosophila Grooming Behavior at JoVE.com

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare individuelle Grooming-Assay-Technik in Drosophila , die robuste, quantitative Daten liefert, um das Groomverhalten zu messen. Die Methode basiert auf dem Vergleich der Unterschied in der Farbstoff-Akkumulation auf die Körper von ungezügelten versus gepflegten Tiere über einen festgelegten Zeitraum.

Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

The overall goal of this method is to measure the grooming behavior of Drosophila by quantifying and comparing the remainder of colored brilliant yellow dye on the body of the animals in groomed and ungroomed conditions. This method can help answer key questions in the field of neurobiology and behavioral genetics such as the coordination of fine locomotive skills and the associated molecular regulators and circuits. The main advantage is as of this technique, are that it's rapid, robust and easy to perform by many experimentalists and students at a variety of skill levels.Demonstrating this procedure will be Frankie Barradale, a student in my laboratory. To begin the experiment, prepare an aspirator to move live Drosophila from a culture vial to the grooming chamber. Using scissors, cut 1.5 feet of Tygon tubing.Cut at least one inch of the tip of a one milliliter disposable micro-pipette tip and hold the one centimeter square piece of mesh over the 196 inch opening of the cut tip. Snugly place a fresh, one milliliter micro-pipette tip over the mesh and cut tip to create a holding chamber for flies. Cut the extreme tip of the new micro-pipette tip to widen the opening enough to allow the passage of a single fly.The hole will roughly match the opening of the grooming chamber. Snugly fit the nested tips onto the end of the Tygon tubing. Push the tips into the tube to ensure a tight fit to allow for vacuum pressure.On the other end of the tubing, cut the tip of a 200 milliliter micro-pipette tip and fit the narrow cut end into the tubing to form the mouth side of the aspirator. To prepare dust aliquot tubes, weigh five milligrams of brilliant yellow dye on weighing paper. Pour the dust into a 8 milliliter micro-centrifuge tube and tightly close the cap.Next, to prepare ethanol tubes, pipette one milliliter of 100%ethanol into 15 milliliter micro-centrifuge tubes. Label the tubes, cap and save the ethanol tubes for completion of the grooming assay. Also include at least one blank sample with only one milliliter of ethanol without a fly for negative controls.Assemble each grooming chamber by screwing the sliding top plate with the smaller holes, but leaving the bottom plate with the larger holes removed for the addition of the dust. Place each necessary grooming chamber flat on a table with the top face-down. Load five milligrams of brilliant yellow dye aliquot into each chamber, by tapping the tube against the surface of the chamber above the desired well.Tap the chamber against the table to ensure that all the dust falls through the mesh to the top of the plate. Then screw the bottom plate onto each chamber, so the wider ends of the conical openings face outward and the holes do not rest over the wells. Secure the bottom plate tightly, so that it does not slide and release dye.Flip the chamber over and knock it flat against the table a few times so that the dust falls through the mesh to rest on the bottom plate. Slide the top plate of the chamber into the open positions that the small holes align with the 15 wells, allowing the introduction of flies into the individual wells. Load one fly into the mouth aspirator by gently sucking through one end of the aspirator as if using a straw.Deposit the flies by lightly blowing and directing the opening toward the target. After loading a well, slide the top plate so that the fly is trapped in the chamber and place tape over the opening of the well during the loading of the hole chamber, to prevent the fly's escape while loading the other wells. If multiple flies are aspirated into a single well, leave that opening uncovered until only one fly remains.After all of the necessary wells are filled with flies, flip the chamber so that the bottom plate is upward and the dust has the potential to coat the flies by falling through the mesh. Tightly secure the top and bottom plates by tightening the screws and vortex the chamber to dust the flies for four seconds. Knock the chamber, top plate face-down against the table twice, so that the dye falls through the other side.Then, flip the chamber over, top plate face-up and knock the chamber twice, to ensure dye settles on the floor of the bottom chamber, away from the fly, held in the top chamber. For control flies, which are not allowed to groom, immediately proceed to sample preparation. Rest the chamber flat on the table or countertop, with the top plate upward for 30 minutes to allow the flies to groom.Place the chamber in a noise vibration free space, to keep your environment constant for all grooming experiments. Keeping the chamber level with the top plate upward, gently unscrew the bottom plate and remove it from the chamber, taking care not to lose any dye. Place the chamber on a CO2 pad with low air flow until the flies are anesthetized.Unscrew the top plate from the chamber, carefully use forceps to grab a leg and remove one dusted fly from each chamber and deposit it in a 1.5 milliliter micro-centrifuge tube containing ethanol. Once each micro-centrifuge tube contains one fly, close the cap and invert the tubes three times to agitate and mix the solution of dye and ethanol. Incubate the tubes containing ethanol and flies for five hours at room temperature to ensure full removal of the dye from the fly into solution.After five hours, briefly vortex each tube for two seconds to ensure clearance of the dyes from the flies. Aliquot 50 microliters of the experimental 1.5 milliliter tube into a well of a 96 well plate, taking note of the location of each sample on the plate. Add 200 microliters of ethanol to dilute the sample five times to avoid sealing effects of heavily dusted flies or large grooming defects.Use a plate reader to analyze each sample at 397 nanometers. Record the sample through the plate reader and save the spreadsheet with the recording samples on the plate. We used this method to study DopR by comparing the grooming performance of a strong hypomorph and to null DopR mutants to a wild type strain.The DopR mutants retained significantly more dye than their wild type of rescued counterparts, indicating that the DopR mutants were less efficient at grooming behavior. In a parallel experiment of Rutabaga flies, mutants display the higher dye accumulation levels than DopR mutants, suggesting a significant role of DopR in grooming behavior. After watching this video, you should have a good understanding of how to handle flies for behavioral assays and also measure the grooming behavior.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetische Stimulation von Escape Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Einfache Assay zur Quantifizierung von Sozialvermeidung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...