Name: quantification of drosophila grooming behavior
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Drosophila Grooming Behavior at JoVE.com

אנו רוצים להודות בריאן שפרד, טאט אודומריטרוג&#39;רוג, אהרון ויללי, רובי פרום, אליס פיטמון, ורד הדרין לעבודה מוקדמת בבדיקות והקמת מתודולוגיה זו עיצובים קאמריים. אנו מודים לקלי טלז ולגרהם בוקאן על קריאה ועריכה של כתב היד. אנו מודים אנדרו זרעים וג &#39;ולי סימפסון על העבודה החלוצית שלהם ואת העצה שלהם ואת התמיכה בהצעה להשתמש Brilliant צהוב Dye (Sigma). עבודה זו נתמכת בין השאר על ידי מרי א &#39;גרוף כירורגית מחקר רפואי קרן חינוך, מרכז המדע ברונפמן, ואת תוכנית עמיתי הלמן.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aspirator להזיז תסיסנית לחיות מתוך בקבוקון תרבות לחדר grooming. Aspirators לאפשר העברת בעלי חיים מודעים לתאי התנהגות כדי להבטיח כי הרדמה אינה משפיעה על התצפית ההתנהגותית שלאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl">...

<ol>
	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster.">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Organization+and+Postural+Facilitation+-+Rules+for+Grooming+in+Flies.">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951 (2014).</li><li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila.">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li><li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100 (2011).</li><li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders.">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine.">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li><li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila.">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li><li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMB,+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies.">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li><li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines.">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li><li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+D1+family+dopamine+receptor,+DopR,+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila.">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li><li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

Assay הטיפוח הוא פשוט יחסית, אבל היינו הזהיר הניסויים להקדיש תשומת לב מיוחדת בנושאים הבאים. שמירה על חותם הדוק על ידי הידוק הברגים על צלחות העליון והתחתון לאחר החדרת זבובים וצבע הוא חיוני עבור תוצאות לשחזור. צבע צהוב מבריק הוא מאוד בסדר המפרקים רופפת יאפשר הפסדים של צבע...

Grooming ב תסיסנית melanogaster ( ד melanogaster ) היא התנהגות מולדת חזקה הכוללת את התיאום של מספר רב של תוכניות עצמאיות המנוע 1 . פירות זבובים לנקות את גופם של אבק, חיידקים, פתוגנים אחרים שיכולים לעכב תפקוד פיזיולוגי נורמלי כגון חזון הטיסה, או להוביל לאתגרים חיסונית משמעותית. בחישה ובמענה לפעולה מכנית 2 ופעילות חיסונית 3 , זבובים משפשפים שוב ושוב את רגליהם או על אזור גוף ממוקד עד שהוא נקי מספיק והטיפוח מתקדם לחלק אחר של הגוף. זבובים לבצע תנועות grooming ב מובהק bouts כי מתרחשות בעיקר בדפוסים סטריאוטיפיים 1 , 4 . היררכיה התנהגותית מתבהרת כאשר אותות הטיפוח מסודרים לפי סדר עדיפויות. מעגלים ודפוסי פעילות זוהו בתמיכהFa, כי תוכניות הטיפוח בחלק העליון של ההיררכיה להתרחש הראשון לדכא אותות מקבילים מאזורים של הגוף כי הם groomed לאחר מכן 5 . העדיפות הגבוהה ביותר ניתנת לראש, אחר כך את הבטן, כנפיים, ולבסוף את בית החזה 5 . תוכנית הטיפוח ב- D. melanogaster היא מערכת אידיאלית לחקר מעגלים עצביים, אותות מולקולריים מודולאריים ומעבירים נוירוטרנסמיטריים. לדוגמה, פשרה של תפקוד neurofibromin 6 , אובדן של תסיסנית X חלבונים פיגור שכלי נפשי ( dfmr1 ) 7 , וחשיפה bisphenol A (BPA) 8 כל לגרום להתנהגויות מוגזמות והתנהגויות אחרות אשר מקביל לסימפטומים אנושיים נפרדים של neurofibromatosis, שביר X תסמונת, ואת ההיבטים של הפרעות ספקטרום האוטיזם הפרעת קשב וריכוז Hyperactivity הפרעת (ADHD), בהתאמה. התנהגות Grooming יכול להיות גם הרגלטד דיפרנציאלי על פני זנים מוטציה 2 , ההלוואות זו תוכנית המנוע ללימודי גמישות התנהגותית. רוחב התופעות הנוירולוגיות שניתן לדגם על ידי תסיסנית דורש גישה השוואתית חדשה למדוד את היכולת של זבובים לחתן את עצמם. הפעולה המשולבת של מובילי monoamine שלפוחית ​​ואת השפע היחסי של דופמין ואמינים ביוגניים אחרים בגוף הוכחו לתווך זבוב פרי התנהגות grooming 9 , 10 . Octopamine ודופאמין לעורר פעילות טיפוח hindleg דומה זבובים ערופים, בעוד טירמין, החומר המוצא לייצור octopamine, תופעל גם טיפוח ובמידה פחותה 7. ארבעה קולטנים דופאמין זוהו ב ד melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup&gt; על ידי שימוש בשיטה assay הטיפוח המתואר בפרוטוקול זה, קבענו תפקיד עבור סוג אני משפחה Dopamine קולטן DopR ( DopR, dDA1, מטומטם ) ב hindleg התנהגות grooming 15 . הטיפוח ניתן לכימות בעקיפין על ידי הסתכלות על מידת הניקיון שבו חיה יכולה לחתוך באופן מלא לאחר אבק לכל הגוף עם צבע סמן או אבק פלואורסצנטי 5 , 16 . שאר שאריות האבק שנותרו על הגוף יכולות לשמש כסמן יחסי להתנהגות הכללית. זבובים מאובקים לאחר שקיבלו מספיק זמן כדי החתן עשוי להיות לידי ביטוי גירעון מסוים בהתנהגות grooming. כמו חקירות הטיפוח הפכו נרחב יותר, פרוטוקולים שולבו פרקטיקות כגון עריפת ראש כדי להוסיף טיפולים תרופתי על הצוואר עצבי החיבור 10 , גירוי מישוש של זיפים כדי לעורר את התגובה grooming 2 ,והקלטת וידאו של התנהגות 15 . תצפית ישירה של הטיפוח ניתן ללמוד בקלות באמצעות תצפית חזותית הקלטה ידנית של תדירות ומשך של אירועים grooming ספציפיים 4 . עיצבנו חמישה עשר חדרים grooming כי ניתן לבנות עם מדפסת 3D או חותך לייזר, ואת עיצובים תכנית מתאר זמינים עבור רבייה 15 . העיצוב משתמש בשני לוחות מרכזיים מחוברים עם פתחים מתאימים מופרדים על ידי רשת ושני לוחות הזזה העליון והתחתון, שממנו זבובים ו / או צבע נטען, בהתאמה. לאחר המאפשרים זבובים אבק זמן החתן, אנו להפקיד אותם אתנול כדי solubilize לצבוע ולמדוד את ספיגת של פתרון זה באורך גל של צבע. קורא צלחת ניתן להשתמש בדגמים מקבילים מרובים או ספקטרופוטומטר יחיד לקרוא ניתן להשתמש עבור דגימות בודדות. שיטה זו ממזער את השגיאה המושרה על ידי טיפול אלLows עבור grooming assays להיות לרוץ על קטן, חסכונית בקנה מידה. שיטה זו נגזרת ו שונה מן השיטות חלוץ על ידי ג &#39;ולי סימפסון אנדרו זרעים, אשר משתמשים בתאי grooming גדול עם אלמנטים חימום עבור מניפולציות מעגל טמפרטורה רגישה 5 . פרוטוקול הבא מציג את כימות של הטיפוח של הגוף כולו, כמו גם מראה שיטות חלופיות quantitation של הצטברות צבע על חלקי גוף בודדים. כמו כן, אנו מציגים נתוני השוואה מדגם בין מוטציות WT ו- DopR , כמו גם שיטות לחישוב מדד ביצועים פשוט להתנהגות הטיפוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5229K54</td>
			<td>ID 1/8&#34;, OD 1/4&#34;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (1ml and 200ul)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-165, 24-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Screen, 2&#34; x 2.6&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9318T44</td>
			<td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Yellow Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201375-25G</td>
			<td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>set to &#34;touch&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>86-1282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10025-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20170-293</td>
			<td>tubes can be reused with successive assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>26014017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HTX Platereader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>need to download catalog to access product number</td>
			<td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; acrylic plastic</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8473K341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 nuts</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90257A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A199</td>
			<td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1/2&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A194</td>
			<td>the second plate from the top needs to be tapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-56 3/8&#34; flat head phillips machine screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91500A088</td>
			<td>these hold the two middle plates together</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.175&#34; ID, 1/4&#34; OD, 0.34&#34; aluminum pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92510A044</td>
			<td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&#160; These act as sheaths for the 1&#34; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of drosophila grooming behavior

תסמונת הטיפוח ההתנהגות היא מורכבת מורכבים צעד רב תוכנית הדורשת תנועה מתואמת של שתי קדמיות ו hindlegs. כאן אנו מציגים פרוטוקול assay grooming עיצוב קאמרית הרומן כי הוא חסכוני וניתן להרחבה עבור מחקרים קטנים או בקנה מידה גדול של תסיסנית תסיסנית . זבובים מאובקים בכל הגוף שלהם עם צבע צהוב מבריק ניתנה זמן כדי להסיר את הצבע מגופם בתוך החדר. זבובים מופקדים אז בנפח קבוע של אתנול כדי solubilize את הצבע. ספיגה ספקטרלית יחסית של דגימות אתנול לצבוע עבור חיות מטופחות לעומת מטומטמים נמדדים ומתועדים. פרוטוקול התשואות נתונים כמותיים של הצטברות צבע עבור זבובים בודדים, אשר ניתן בקלות ממוצעים לעומת דגימות. זה מאפשר עיצובים ניסיוניים בקלות להעריך יכולת הטיפוח עבור מחקרים בבעלי חיים מוטציה או מניפולציות מעגל. הליך זה יעיל הוא גם צדדי וניתן להרחבה. אנו מראים wזרימת אורק של הפרוטוקול ונתונים השוואתיים בין בעלי חיים WT לבין בעלי חיים מוטנטים עבור סוג תסיסנית אני דופמין קולטן ( DopR ).

Assay הטיפוח תשואות נתונים כמותיים כדי להעריך את הביצועים ההתנהגותיים על בסיס שארית יחסית של צבע שנצבר נותר על גופים של זבובים לאחר זמן מוגדר של המדידה לטיפוח (30 דקות). תמונות לדוגמה של עיצוב חדר השינה grooming השלבים העיקריים של assay מודגשים בתרשים 1</str...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Drosophila Grooming Behavior at JoVE.com

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

פרוטוקול זה מתאר טכניקה assay להרחבה אישית assay בתסיסנית כי התשואות נתונים חזקים, כמותיים כדי למדוד התנהגות הטיפוח. השיטה מבוססת על השוואת ההבדל הצטברות צבע על גופים של חיות מטופחות לעומת מטופח על פני תקופה של זמן.

כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

The overall goal of this method is to measure the grooming behavior of Drosophila by quantifying and comparing the remainder of colored brilliant yellow dye on the body of the animals in groomed and ungroomed conditions. This method can help answer key questions in the field of neurobiology and behavioral genetics such as the coordination of fine locomotive skills and the associated molecular regulators and circuits. The main advantage is as of this technique, are that it's rapid, robust and easy to perform by many experimentalists and students at a variety of skill levels.Demonstrating this procedure will be Frankie Barradale, a student in my laboratory. To begin the experiment, prepare an aspirator to move live Drosophila from a culture vial to the grooming chamber. Using scissors, cut 1.5 feet of Tygon tubing.Cut at least one inch of the tip of a one milliliter disposable micro-pipette tip and hold the one centimeter square piece of mesh over the 196 inch opening of the cut tip. Snugly place a fresh, one milliliter micro-pipette tip over the mesh and cut tip to create a holding chamber for flies. Cut the extreme tip of the new micro-pipette tip to widen the opening enough to allow the passage of a single fly.The hole will roughly match the opening of the grooming chamber. Snugly fit the nested tips onto the end of the Tygon tubing. Push the tips into the tube to ensure a tight fit to allow for vacuum pressure.On the other end of the tubing, cut the tip of a 200 milliliter micro-pipette tip and fit the narrow cut end into the tubing to form the mouth side of the aspirator. To prepare dust aliquot tubes, weigh five milligrams of brilliant yellow dye on weighing paper. Pour the dust into a 8 milliliter micro-centrifuge tube and tightly close the cap.Next, to prepare ethanol tubes, pipette one milliliter of 100%ethanol into 15 milliliter micro-centrifuge tubes. Label the tubes, cap and save the ethanol tubes for completion of the grooming assay. Also include at least one blank sample with only one milliliter of ethanol without a fly for negative controls.Assemble each grooming chamber by screwing the sliding top plate with the smaller holes, but leaving the bottom plate with the larger holes removed for the addition of the dust. Place each necessary grooming chamber flat on a table with the top face-down. Load five milligrams of brilliant yellow dye aliquot into each chamber, by tapping the tube against the surface of the chamber above the desired well.Tap the chamber against the table to ensure that all the dust falls through the mesh to the top of the plate. Then screw the bottom plate onto each chamber, so the wider ends of the conical openings face outward and the holes do not rest over the wells. Secure the bottom plate tightly, so that it does not slide and release dye.Flip the chamber over and knock it flat against the table a few times so that the dust falls through the mesh to rest on the bottom plate. Slide the top plate of the chamber into the open positions that the small holes align with the 15 wells, allowing the introduction of flies into the individual wells. Load one fly into the mouth aspirator by gently sucking through one end of the aspirator as if using a straw.Deposit the flies by lightly blowing and directing the opening toward the target. After loading a well, slide the top plate so that the fly is trapped in the chamber and place tape over the opening of the well during the loading of the hole chamber, to prevent the fly's escape while loading the other wells. If multiple flies are aspirated into a single well, leave that opening uncovered until only one fly remains.After all of the necessary wells are filled with flies, flip the chamber so that the bottom plate is upward and the dust has the potential to coat the flies by falling through the mesh. Tightly secure the top and bottom plates by tightening the screws and vortex the chamber to dust the flies for four seconds. Knock the chamber, top plate face-down against the table twice, so that the dye falls through the other side.Then, flip the chamber over, top plate face-up and knock the chamber twice, to ensure dye settles on the floor of the bottom chamber, away from the fly, held in the top chamber. For control flies, which are not allowed to groom, immediately proceed to sample preparation. Rest the chamber flat on the table or countertop, with the top plate upward for 30 minutes to allow the flies to groom.Place the chamber in a noise vibration free space, to keep your environment constant for all grooming experiments. Keeping the chamber level with the top plate upward, gently unscrew the bottom plate and remove it from the chamber, taking care not to lose any dye. Place the chamber on a CO2 pad with low air flow until the flies are anesthetized.Unscrew the top plate from the chamber, carefully use forceps to grab a leg and remove one dusted fly from each chamber and deposit it in a 1.5 milliliter micro-centrifuge tube containing ethanol. Once each micro-centrifuge tube contains one fly, close the cap and invert the tubes three times to agitate and mix the solution of dye and ethanol. Incubate the tubes containing ethanol and flies for five hours at room temperature to ensure full removal of the dye from the fly into solution.After five hours, briefly vortex each tube for two seconds to ensure clearance of the dyes from the flies. Aliquot 50 microliters of the experimental 1.5 milliliter tube into a well of a 96 well plate, taking note of the location of each sample on the plate. Add 200 microliters of ethanol to dilute the sample five times to avoid sealing effects of heavily dusted flies or large grooming defects.Use a plate reader to analyze each sample at 397 nanometers. Record the sample through the plate reader and save the spreadsheet with the recording samples on the plate. We used this method to study DopR by comparing the grooming performance of a strong hypomorph and to null DopR mutants to a wild type strain.The DopR mutants retained significantly more dye than their wild type of rescued counterparts, indicating that the DopR mutants were less efficient at grooming behavior. In a parallel experiment of Rutabaga flies, mutants display the higher dye accumulation levels than DopR mutants, suggesting a significant role of DopR in grooming behavior. After watching this video, you should have a good understanding of how to handle flies for behavioral assays and also measure the grooming behavior.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב<em&gt; דרוזופילה</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Assay הפשוט לכימות חברתיות הימנעות ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

צביעת חרקים למבחני התנהגות: התנהגות חיזור של הרדים<em&gt; דרוזופילה</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...