Name: quantification of drosophila grooming behavior
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00
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Desideriamo ringraziare Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon e Rose Hedreen per iniziare a sperimentare e stabilire questa metodologia e progetti di camera. Ringraziamo Kelly Tellez e Graham Buchan per la lettura e la modifica del manoscritto. Ringraziamo Andrew Seeds e Julie Simpson per il loro lavoro pionieristico e il loro consiglio e supporto per suggerire l&#39;uso di Brilliant Yellow Dye (Sigma). Questo lavoro è sostenuto in parte da Mary E. Groff Chirurgia e Ricerca Medica e Educazione Charitable Trust, il Bronfman Science Center, e Hellman Fellows Program.

1. Preparazione <ol><li> Preparare un aspiratore per spostare Drosophila vivo da un flaconcino di cultura alla camera di cura. Gli aspirazione consentono il trasferimento di animali coscienti alle camere comportamentali per assicurare che l&#39;anestesia non pregiudichi l&#39;osservazione comportamentale successiva. <ol><li> Usando le forbici tagliate 1,5 piedi di tubo TYGON ID ⅛ &quot;, OD ¼&quot;. Cucito almeno 1 pollice fuori dalla punta di una punta da 1 ml di micropipetta usa e getta....

<ol>
	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster.">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Organization+and+Postural+Facilitation+-+Rules+for+Grooming+in+Flies.">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li><li>Seeds, A. 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A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100 (2011).</li><li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders.">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine.">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li><li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila.">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li><li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMB,+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies.">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li><li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines.">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li><li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+D1+family+dopamine+receptor,+DopR,+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila.">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li><li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

Il test di cura è relativamente semplice, ma avremmo cautela i sperimentatori a prestare particolare attenzione ai seguenti problemi. Il mantenimento di una guarnizione a tenuta stretta delle viti sulle piastre superiore e inferiore dopo l&#39;introduzione di mosche e tinture è essenziale per i risultati riproducibili. Il colorante giallo brillante è molto fine e le giunture sciolte consentiranno perdite di tintura dai bordi della camera. L&#39;irregolarità del contenuto di tinture per ciascun pozzetto potrebbe faci...

Il grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) è un comportamento robusto innato che coinvolge il coordinamento di più programmi motori indipendenti 1 . I frutti volano puliscono i loro corpi di polvere, microbi e altri agenti patogeni che potrebbero inibire la normale funzione fisiologica, come la vista e il volo, o portare a importanti sfide immunitarie. Nel rilevare e reagire sia all&#39;attivazione meccanica 2 che all&#39;immunizzazione 3 , le mosche si ripetono a strofinare le gambe insieme o su una regione corporea mirata fino a quando non è sufficientemente pulita e il grooming progredisce in un&#39;altra parte del corpo. Le mosche svolgono movimenti di governare in attacchi distinti che in gran parte si verificano nei modelli stereotipati 1 , 4 . Una gerarchia comportamentale diventa evidente come i segnali di governare sono prioritizzati. Circuiti e modelli di attività sono stati identificati in supporto oFa il modello che i programmi di grooming in cima alla gerarchia si verificano in primo luogo e sopprimono i segnali paralleli da aree del corpo che vengono curate in seguito 5 . La massima priorità è data alla testa, poi all&#39;addome, alle ali e infine al torace 5 . Il programma di grooming in D. melanogaster è un sistema ideale per studiare circuiti neurali, segnali molecolari modulatori e neurotrasmettitori. Ad esempio, il compromesso della funzione neurofibromina 6 , la perdita della proteina Drosophila fragile X retardazione mentale ( dfmr1 ) 7 e l&#39;esposizione a bisfenolo A (BPA) 8 provocano eccessivi trattamenti e altri comportamenti analoghi ai sintomi umani discreti di neurofibromatosi, fragili X Sindrome e aspetti dei disordini dello spettro autistico e disordine di iperattività (ADHD). Il comportamento di grooming può anche essere habituaTed differenzialmente attraverso i ceppi mutanti 2 , prestando questo programma motore a studi di plasticità comportamentale. L&#39;ampiezza dei fenomeni neurologici che può essere modellata da Drosophila richiede un nuovo approccio comparativo per misurare la capacità delle mosche di sposarsi. Si è dimostrato che l&#39;azione combinata di trasportatori di monoammina vescicolare e la relativa abbondanza di dopamina e di altre ammine biogene nel corpo sono in grado di mediare il comportamento della volatili da frutta 9 , 10 . L&#39;ottopamina e la dopamina stimolano un&#39;attività comparativa di regolazione del collo posteriore nelle mosche decapitate, mentre la tiramina, precursore della ottopamina, innesca anche un grooming in misura minore 7 . Quattro recettori della dopamina sono stati identificati in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;. Utilizzando il metodo di analisi di grooming descritto in questo protocollo, abbiamo determinato un ruolo per il tipo D di Dopamine Receptor DopR ( DopR, dDA1, dumb ) nel comportamento pastorale 15 . Il grooming può essere quantificato indirettamente guardando l&#39;estensione della pulizia con cui un animale può spogliarsi completamente dopo aver spolverato tutto il corpo con un colorante marcatore o una polvere fluorescente 5 , 16 . Il resto della polvere lasciato sul corpo può essere utilizzato come marcatore relativo per il comportamento complessivo. Dusty vola dopo essere stato dato tempo sufficiente per lo sposo può manifestare un deficit specifico nel comportamento grooming. Mentre le indagini di cura sono diventate più estese, i protocolli hanno incorporato tali pratiche come la decapitazione per aggiungere trattamenti farmacologici sui nervi connettivi del collo 10 , stimolazione tattile delle setole per ottenere la risposta di grooming 2 ,E la registrazione video del comportamento 15 . L&#39;osservazione diretta del grooming può essere facilmente studiata utilizzando l&#39;osservazione visiva e registrando manualmente la frequenza e la durata di eventi specifici di grooming 4 . Abbiamo progettato una camera da 15 grosse dimensioni che può essere costruita con una stampante 3D o una taglierina laser e i disegni dei modelli sono disponibili per la riproduzione 15 . Il disegno utilizza due piastre centrali unite con aperture abbinate e separate da maglie e due piastre superiore e inferiore di scorrimento aggiuntive, da cui sono caricate rispettivamente mosche e / o tinture. Dopo aver lasciato alle spalle le mosche spolverate, lo depositi in etanolo per solubilizzare il colorante e misurare l&#39;assorbanza di questa soluzione alla lunghezza d&#39;onda del colorante. Un lettore di piastre può essere utilizzato per campioni multipli paralleli o uno spettrofotometro a singolo lettura può essere utilizzato per campioni individuali. Questo metodo minimizza l&#39;errore indotto dalla manipolazione e alI bassi per i test di cura da eseguire su una scala più economica ed economica. Questo metodo è derivato e modificato dai metodi precedenti da Julie Simpson e Andrew Seeds, che utilizzano camere di grooming più grandi con elementi di riscaldamento per manipolazioni di circuiti sensibili alle temperature 5 . Il seguente protocollo mostra la quantificazione della cura di tutto il corpo e mostra metodi alternativi per la quantificazione dell&#39;accumulazione di coloranti sulle singole parti del corpo. Inoltre presentiamo i dati di confronto campione tra i mutanti WT e DopR , nonché i metodi per calcolare un indice di performance semplice per il comportamento di grooming.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5229K54</td>
			<td>ID 1/8&#34;, OD 1/4&#34;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (1ml and 200ul)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-165, 24-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Screen, 2&#34; x 2.6&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9318T44</td>
			<td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Yellow Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201375-25G</td>
			<td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>set to &#34;touch&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>86-1282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10025-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20170-293</td>
			<td>tubes can be reused with successive assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>26014017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HTX Platereader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>need to download catalog to access product number</td>
			<td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; acrylic plastic</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8473K341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 nuts</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90257A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A199</td>
			<td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1/2&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A194</td>
			<td>the second plate from the top needs to be tapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-56 3/8&#34; flat head phillips machine screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91500A088</td>
			<td>these hold the two middle plates together</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.175&#34; ID, 1/4&#34; OD, 0.34&#34; aluminum pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92510A044</td>
			<td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&#160; These act as sheaths for the 1&#34; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of drosophila grooming behavior

Il comportamento di grooming di Drosophila è un complesso programma locomotore multiplo che richiede un movimento coordinato di entrambi i lati e le zampe. Qui presentiamo un protocollo di dosaggio e un nuovo disegno a camera che è economicamente efficiente e scalabile per studi su piccola o larga scala di Drosophila . Le mosche vengono spolverate in tutto il corpo con la colorazione gialla brillante e hanno dato tempo per rimuovere il colorante dai loro corpi all&#39;interno della camera. Le mosche vengono quindi depositate in un determinato volume di etanolo per solubilizzare il colorante. Sono misurate e registrate l&#39;assorbanza spettrale relativa dei campioni di coloranti etanolo per animali da allevamento contro animali non macellati. Il protocollo fornisce dati quantitativi di accumulo di tinture per singole mosche, che possono essere facilmente mediate e confrontate tra campioni. Ciò consente ai disegni sperimentali di valutare facilmente le abilità di cura per gli studi sugli animali mutati o sulle manipolazioni dei circuiti. Questa procedura efficace è versatile e scalabile. Mostriamo wOrc-flow del protocollo e dati comparativi tra animali WT e animali mutanti per il Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).

Il dosaggio di cure rende dati quantitativi per valutare le prestazioni comportamentali basate sul residuo relativo della colorante accumulata lasciata sui corpi delle mosche dopo un tempo di misura impostato per la cura (30 min). Le figure di esempio del disegno della camera di scorrimento scorrevole e delle fasi principali del dosaggio sono evidenziate in figura 1 . Le mosche aggregano una quantità significativa di tintura dalla polverizzazione immedi...

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Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Questo protocollo descrive una tecnica di dosaggio individuale scalabile di dosaggio in Drosophila che fornisce dati robusti e quantitativi per misurare il comportamento di manipolazione. Il metodo si basa sulla comparazione della differenza di accumulo di tinture nei corpi di animali non trattati e trattati in un determinato periodo di tempo.

Quantificazione del comportamento del grooming di Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

The overall goal of this method is to measure the grooming behavior of Drosophila by quantifying and comparing the remainder of colored brilliant yellow dye on the body of the animals in groomed and ungroomed conditions. This method can help answer key questions in the field of neurobiology and behavioral genetics such as the coordination of fine locomotive skills and the associated molecular regulators and circuits. The main advantage is as of this technique, are that it's rapid, robust and easy to perform by many experimentalists and students at a variety of skill levels.Demonstrating this procedure will be Frankie Barradale, a student in my laboratory. To begin the experiment, prepare an aspirator to move live Drosophila from a culture vial to the grooming chamber. Using scissors, cut 1.5 feet of Tygon tubing.Cut at least one inch of the tip of a one milliliter disposable micro-pipette tip and hold the one centimeter square piece of mesh over the 196 inch opening of the cut tip. Snugly place a fresh, one milliliter micro-pipette tip over the mesh and cut tip to create a holding chamber for flies. Cut the extreme tip of the new micro-pipette tip to widen the opening enough to allow the passage of a single fly.The hole will roughly match the opening of the grooming chamber. Snugly fit the nested tips onto the end of the Tygon tubing. Push the tips into the tube to ensure a tight fit to allow for vacuum pressure.On the other end of the tubing, cut the tip of a 200 milliliter micro-pipette tip and fit the narrow cut end into the tubing to form the mouth side of the aspirator. To prepare dust aliquot tubes, weigh five milligrams of brilliant yellow dye on weighing paper. Pour the dust into a 8 milliliter micro-centrifuge tube and tightly close the cap.Next, to prepare ethanol tubes, pipette one milliliter of 100%ethanol into 15 milliliter micro-centrifuge tubes. Label the tubes, cap and save the ethanol tubes for completion of the grooming assay. Also include at least one blank sample with only one milliliter of ethanol without a fly for negative controls.Assemble each grooming chamber by screwing the sliding top plate with the smaller holes, but leaving the bottom plate with the larger holes removed for the addition of the dust. Place each necessary grooming chamber flat on a table with the top face-down. Load five milligrams of brilliant yellow dye aliquot into each chamber, by tapping the tube against the surface of the chamber above the desired well.Tap the chamber against the table to ensure that all the dust falls through the mesh to the top of the plate. Then screw the bottom plate onto each chamber, so the wider ends of the conical openings face outward and the holes do not rest over the wells. Secure the bottom plate tightly, so that it does not slide and release dye.Flip the chamber over and knock it flat against the table a few times so that the dust falls through the mesh to rest on the bottom plate. Slide the top plate of the chamber into the open positions that the small holes align with the 15 wells, allowing the introduction of flies into the individual wells. Load one fly into the mouth aspirator by gently sucking through one end of the aspirator as if using a straw.Deposit the flies by lightly blowing and directing the opening toward the target. After loading a well, slide the top plate so that the fly is trapped in the chamber and place tape over the opening of the well during the loading of the hole chamber, to prevent the fly's escape while loading the other wells. If multiple flies are aspirated into a single well, leave that opening uncovered until only one fly remains.After all of the necessary wells are filled with flies, flip the chamber so that the bottom plate is upward and the dust has the potential to coat the flies by falling through the mesh. Tightly secure the top and bottom plates by tightening the screws and vortex the chamber to dust the flies for four seconds. Knock the chamber, top plate face-down against the table twice, so that the dye falls through the other side.Then, flip the chamber over, top plate face-up and knock the chamber twice, to ensure dye settles on the floor of the bottom chamber, away from the fly, held in the top chamber. For control flies, which are not allowed to groom, immediately proceed to sample preparation. Rest the chamber flat on the table or countertop, with the top plate upward for 30 minutes to allow the flies to groom.Place the chamber in a noise vibration free space, to keep your environment constant for all grooming experiments. Keeping the chamber level with the top plate upward, gently unscrew the bottom plate and remove it from the chamber, taking care not to lose any dye. Place the chamber on a CO2 pad with low air flow until the flies are anesthetized.Unscrew the top plate from the chamber, carefully use forceps to grab a leg and remove one dusted fly from each chamber and deposit it in a 1.5 milliliter micro-centrifuge tube containing ethanol. Once each micro-centrifuge tube contains one fly, close the cap and invert the tubes three times to agitate and mix the solution of dye and ethanol. Incubate the tubes containing ethanol and flies for five hours at room temperature to ensure full removal of the dye from the fly into solution.After five hours, briefly vortex each tube for two seconds to ensure clearance of the dyes from the flies. Aliquot 50 microliters of the experimental 1.5 milliliter tube into a well of a 96 well plate, taking note of the location of each sample on the plate. Add 200 microliters of ethanol to dilute the sample five times to avoid sealing effects of heavily dusted flies or large grooming defects.Use a plate reader to analyze each sample at 397 nanometers. Record the sample through the plate reader and save the spreadsheet with the recording samples on the plate. We used this method to study DopR by comparing the grooming performance of a strong hypomorph and to null DopR mutants to a wild type strain.The DopR mutants retained significantly more dye than their wild type of rescued counterparts, indicating that the DopR mutants were less efficient at grooming behavior. In a parallel experiment of Rutabaga flies, mutants display the higher dye accumulation levels than DopR mutants, suggesting a significant role of DopR in grooming behavior. After watching this video, you should have a good understanding of how to handle flies for behavioral assays and also measure the grooming behavior.

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Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larvale Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput analisi del comportamento motorio nell'analisi di Isola della drosofila

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...