Name: quantification of drosophila grooming behavior
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00
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Deseamos agradecer a Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon y Rose Hedreen por sus primeros trabajos en pruebas y establecimiento de esta metodología y diseños de cámara. Agradecemos a Kelly Tellez y Graham Buchan por leer y editar el manuscrito. Damos las gracias a Andrew Seeds y Julie Simpson por su trabajo pionero y su asesoramiento y apoyo en la sugerencia del uso de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Este trabajo es apoyado en parte por el Mary E. Groff Cirugía y Investigación Médica y Educación Charitable Trust, el Bronfman Science Center, y el Hellman Fellows Program.

1. Preparación <ol><li> Preparar un aspirador para mover vivo Drosophila de un frasco de cultivo a la cámara de aseo. Los aspiradores permiten la transferencia de animales conscientes a las cámaras conductuales para asegurar que la anestesia no afecte a la observación conductual posterior. <ol><li> Usando tijeras cortar 1,5 pies de tubería Tygon ID ⅛ &quot;, OD ¼&quot;. Cortar por lo menos 1 pulgada de la punta de una punta de micropipeta desechable de 1 ml. Sostenga un pedazo cuadrad...

<ol>
	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster.">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Organization+and+Postural+Facilitation+-+Rules+for+Grooming+in+Flies.">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951 (2014).</li><li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila.">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li><li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100 (2011).</li><li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders.">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine.">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li><li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila.">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li><li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMB,+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies.">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li><li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines.">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li><li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+D1+family+dopamine+receptor,+DopR,+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila.">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li><li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

El ensayo de aseo es relativamente sencillo, pero recomendamos a los experimentadores que presten especial atención a los siguientes temas. Mantener un sello hermético apretando los tornillos en las placas superiores e inferiores después de introducir las moscas y el tinte es esencial para resultados reproducibles. El colorante Brilliant Yellow es muy fino y las articulaciones sueltas permitirán pérdidas de colorante de los bordes de la cámara. La irregularidad en el contenido de colorante para cada pocillo podrí...

El aseo en Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) es un comportamiento innato robusto que implica la coordinación de múltiples programas motores independientes 1 . Las moscas de la fruta limpian sus cuerpos de polvo, microbios y otros patógenos que podrían inhibir la función fisiológica normal, como la visión y el vuelo, o dar lugar a desafíos inmunológicos importantes. Al detectar y responder tanto a la mecánica 2 como a la activación inmunitaria 3 , las moscas se frotan repetidamente las piernas juntas o en una región del cuerpo objetivo hasta que esté suficientemente limpia y el aseo progrese hacia otra parte del cuerpo. Las moscas realizan movimientos de aseo en episodios distintos que ocurren en gran medida en patrones estereotipados 1 , 4 . Una jerarquía de comportamiento se hace evidente a medida que las señales de aseo se priorizan. Se han identificado circuitos y patrones de actividad paraFa que los programas de aseo en la parte superior de la jerarquía ocurren primero y suprimen las señales paralelas de las áreas del cuerpo que se preparan posteriormente 5 . La máxima prioridad se da a la cabeza, luego al abdomen, alas y finalmente al tórax 5 . El programa de aseo en D. melanogaster es un sistema ideal para estudiar circuitos neuronales, señales moleculares moduladoras y neurotransmisores. Por ejemplo, el compromiso de la función de la neurofibromina 6 , la pérdida de la proteína de retraso mental X frágil de Drosophila ( dfmr1 ) 7 y la exposición al bisfenol A (BPA) 8 causan excesiva higiene y otros comportamientos análogos a los síntomas humanos discretos de neurofibromatosis, X frágil Síndrome y aspectos de los trastornos del espectro autista y trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), respectivamente. El comportamiento de la preparación también puede ser habituaDiferenciadamente a través de las cepas mutantes 2 , otorgando este programa motor a estudios de plasticidad conductual. La amplitud de los fenómenos neurológicos que pueden ser modelados por Drosophila exige un nuevo enfoque comparativo para medir la capacidad de las moscas para prepararse. La acción combinada de transportadores de monoaminas vesiculares y la abundancia relativa de la dopamina y otras aminas biogénicas en el cuerpo se ha demostrado que mediar mosca de la fruta comportamiento 9, 10 de la preparación. La octopamina y la dopamina estimulan la actividad comparativa de aseo de las patas traseras en las moscas decapitadas, mientras que la tiramina, precursora de la octopamina, también desencadena el aseo en menor grado 7 . Se han identificado cuatro receptores de dopamina en D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;. Utilizando el método de ensayo de aseo descrito en este protocolo, se determinó un papel para la familia de Tipo I Dopamine Receptor DopR ( DopR, dDA1, tonto ) en el comportamiento de aseo de la espalda 15 . El aseo se puede cuantificar indirectamente mirando el grado de limpieza por el cual un animal puede prepararse completamente después de limpiar el cuerpo entero con un tinte marcador o polvo fluorescente 5 , 16 . El resto de polvo que queda en el cuerpo puede usarse como un marcador relativo para el comportamiento general. Moscas polvorientas después de ser dado tiempo suficiente para el novio puede estar manifestando un déficit específico en el comportamiento de aseo. A medida que las investigaciones de aseo se han vuelto más extensas, los protocolos han incorporado prácticas tales como la decapitación para agregar tratamientos farmacológicos a los nervios conectivos del cuello 10 , estimulación táctil de cerdas para obtener la respuesta de aseo 2 ,Y grabación de vídeo de comportamiento 15 . La observación directa de la preparación puede ser fácilmente estudiada mediante el uso de la observación visual y el registro manual de la frecuencia y la duración de los eventos de aseo específicos 4 . Diseñamos una cámara de preparación de quince pocillos que puede ser construida con una impresora 3D o cortador láser, y los diseños de planos están disponibles para su reproducción 15 . El diseño utiliza dos placas centrales unidas con aberturas emparejadas y separadas por malla y dos placas deslizantes superiores y inferiores adicionales, de las cuales se cargan moscas y / o tintes, respectivamente. Después de permitir que las moscas espolvoreadas se preparen, se depositan en etanol para solubilizar el colorante y se mide la absorbancia de esta solución a la longitud de onda del colorante. Se puede utilizar un lector de placas para múltiples muestras paralelas o un espectrofotómetro de lectura única para muestras individuales. Este método minimiza el error inducido por la manipulación yBajos para los ensayos de aseo para funcionar en una escala más pequeña y rentable. Este método se deriva y se modifica a partir de los métodos pioneros de Julie Simpson y Andrew Seeds, que utilizan cámaras de grooming más grandes con elementos de calefacción para la temperatura de manipulación de circuitos sensibles [ 5] . El siguiente protocolo muestra la cuantificación de la preparación de todo el cuerpo, así como muestra métodos alternativos para la cuantificación de la acumulación de tinte en partes del cuerpo individuales. También se presentan los datos de comparación de muestras entre WT y DopR mutantes, así como los métodos para calcular un índice de rendimiento simple para el comportamiento de aseo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5229K54</td>
			<td>ID 1/8&#34;, OD 1/4&#34;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (1ml and 200ul)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-165, 24-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Screen, 2&#34; x 2.6&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9318T44</td>
			<td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Yellow Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201375-25G</td>
			<td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>set to &#34;touch&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>86-1282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10025-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20170-293</td>
			<td>tubes can be reused with successive assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>26014017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HTX Platereader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>need to download catalog to access product number</td>
			<td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; acrylic plastic</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8473K341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 nuts</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90257A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A199</td>
			<td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1/2&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A194</td>
			<td>the second plate from the top needs to be tapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-56 3/8&#34; flat head phillips machine screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91500A088</td>
			<td>these hold the two middle plates together</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.175&#34; ID, 1/4&#34; OD, 0.34&#34; aluminum pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92510A044</td>
			<td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&#160; These act as sheaths for the 1&#34; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of drosophila grooming behavior

El comportamiento de aseo de Drosophila es un complejo programa locomotor de varios pasos que requiere un movimiento coordinado tanto de las patas delanteras como de las patas posteriores. Aquí presentamos un protocolo de ensayo de aseo personal y un nuevo diseño de cámara que es rentable y escalable para estudios pequeños o en gran escala de aseo de Drosophila . Las moscas se espolvorean por todo su cuerpo con colorante amarillo brillante y se da tiempo para eliminar el tinte de sus cuerpos dentro de la cámara. Las moscas se depositan entonces en un volumen establecido de etanol para solubilizar el colorante. Se mide y se registra la absorbancia espectral relativa de muestras de tinte-etanol para animales cepillados frente a no cepillados. El protocolo proporciona datos cuantitativos de acumulación de colorantes para las moscas individuales, que pueden ser fácilmente promediados y comparados entre muestras. Esto permite que los diseños experimentales evalúen fácilmente la capacidad de preparación para estudios en animales mutantes o manipulaciones de circuitos. Este procedimiento eficiente es versátil y escalable. Mostramos wOrk-flow del protocolo y datos comparativos entre animales WT y animales mutantes para el Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).

El ensayo de aseo proporciona datos cuantitativos para evaluar el rendimiento del comportamiento basado en el resto relativo del colorante acumulado que queda sobre los cuerpos de moscas después de un tiempo establecido de medición para el aseo (30 min). En la Figura 1 se destacan imágenes de muestra del diseño de la cámara de limpieza deslizante y los pasos principales del ensayo. Las moscas agregan una cantidad significativa de colorante de la formación de polvo ...

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Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Este protocolo describe una técnica de ensayo escalable de aseo personal en Drosophila que proporciona datos robustos y cuantitativos para medir el comportamiento de la preparación. El método se basa en la comparación de la diferencia en la acumulación de colorantes en los cuerpos de los animales no ceñidos frente a los cuidados durante un período determinado de tiempo.

Cuantificación de la Drosophila Grooming Comportamiento

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

The overall goal of this method is to measure the grooming behavior of Drosophila by quantifying and comparing the remainder of colored brilliant yellow dye on the body of the animals in groomed and ungroomed conditions. This method can help answer key questions in the field of neurobiology and behavioral genetics such as the coordination of fine locomotive skills and the associated molecular regulators and circuits. The main advantage is as of this technique, are that it's rapid, robust and easy to perform by many experimentalists and students at a variety of skill levels.Demonstrating this procedure will be Frankie Barradale, a student in my laboratory. To begin the experiment, prepare an aspirator to move live Drosophila from a culture vial to the grooming chamber. Using scissors, cut 1.5 feet of Tygon tubing.Cut at least one inch of the tip of a one milliliter disposable micro-pipette tip and hold the one centimeter square piece of mesh over the 196 inch opening of the cut tip. Snugly place a fresh, one milliliter micro-pipette tip over the mesh and cut tip to create a holding chamber for flies. Cut the extreme tip of the new micro-pipette tip to widen the opening enough to allow the passage of a single fly.The hole will roughly match the opening of the grooming chamber. Snugly fit the nested tips onto the end of the Tygon tubing. Push the tips into the tube to ensure a tight fit to allow for vacuum pressure.On the other end of the tubing, cut the tip of a 200 milliliter micro-pipette tip and fit the narrow cut end into the tubing to form the mouth side of the aspirator. To prepare dust aliquot tubes, weigh five milligrams of brilliant yellow dye on weighing paper. Pour the dust into a 8 milliliter micro-centrifuge tube and tightly close the cap.Next, to prepare ethanol tubes, pipette one milliliter of 100%ethanol into 15 milliliter micro-centrifuge tubes. Label the tubes, cap and save the ethanol tubes for completion of the grooming assay. Also include at least one blank sample with only one milliliter of ethanol without a fly for negative controls.Assemble each grooming chamber by screwing the sliding top plate with the smaller holes, but leaving the bottom plate with the larger holes removed for the addition of the dust. Place each necessary grooming chamber flat on a table with the top face-down. Load five milligrams of brilliant yellow dye aliquot into each chamber, by tapping the tube against the surface of the chamber above the desired well.Tap the chamber against the table to ensure that all the dust falls through the mesh to the top of the plate. Then screw the bottom plate onto each chamber, so the wider ends of the conical openings face outward and the holes do not rest over the wells. Secure the bottom plate tightly, so that it does not slide and release dye.Flip the chamber over and knock it flat against the table a few times so that the dust falls through the mesh to rest on the bottom plate. Slide the top plate of the chamber into the open positions that the small holes align with the 15 wells, allowing the introduction of flies into the individual wells. Load one fly into the mouth aspirator by gently sucking through one end of the aspirator as if using a straw.Deposit the flies by lightly blowing and directing the opening toward the target. After loading a well, slide the top plate so that the fly is trapped in the chamber and place tape over the opening of the well during the loading of the hole chamber, to prevent the fly's escape while loading the other wells. If multiple flies are aspirated into a single well, leave that opening uncovered until only one fly remains.After all of the necessary wells are filled with flies, flip the chamber so that the bottom plate is upward and the dust has the potential to coat the flies by falling through the mesh. Tightly secure the top and bottom plates by tightening the screws and vortex the chamber to dust the flies for four seconds. Knock the chamber, top plate face-down against the table twice, so that the dye falls through the other side.Then, flip the chamber over, top plate face-up and knock the chamber twice, to ensure dye settles on the floor of the bottom chamber, away from the fly, held in the top chamber. For control flies, which are not allowed to groom, immediately proceed to sample preparation. Rest the chamber flat on the table or countertop, with the top plate upward for 30 minutes to allow the flies to groom.Place the chamber in a noise vibration free space, to keep your environment constant for all grooming experiments. Keeping the chamber level with the top plate upward, gently unscrew the bottom plate and remove it from the chamber, taking care not to lose any dye. Place the chamber on a CO2 pad with low air flow until the flies are anesthetized.Unscrew the top plate from the chamber, carefully use forceps to grab a leg and remove one dusted fly from each chamber and deposit it in a 1.5 milliliter micro-centrifuge tube containing ethanol. Once each micro-centrifuge tube contains one fly, close the cap and invert the tubes three times to agitate and mix the solution of dye and ethanol. Incubate the tubes containing ethanol and flies for five hours at room temperature to ensure full removal of the dye from the fly into solution.After five hours, briefly vortex each tube for two seconds to ensure clearance of the dyes from the flies. Aliquot 50 microliters of the experimental 1.5 milliliter tube into a well of a 96 well plate, taking note of the location of each sample on the plate. Add 200 microliters of ethanol to dilute the sample five times to avoid sealing effects of heavily dusted flies or large grooming defects.Use a plate reader to analyze each sample at 397 nanometers. Record the sample through the plate reader and save the spreadsheet with the recording samples on the plate. We used this method to study DopR by comparing the grooming performance of a strong hypomorph and to null DopR mutants to a wild type strain.The DopR mutants retained significantly more dye than their wild type of rescued counterparts, indicating that the DopR mutants were less efficient at grooming behavior. In a parallel experiment of Rutabaga flies, mutants display the higher dye accumulation levels than DopR mutants, suggesting a significant role of DopR in grooming behavior. After watching this video, you should have a good understanding of how to handle flies for behavioral assays and also measure the grooming behavior.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

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La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

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Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

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Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

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Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en<em&gt; Drosophila</em

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

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Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamiento de las larvas de arrastre

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

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Análisis de alto rendimiento del comportamiento Locomotor en el ensayo de la isla de Drosophila

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...