Name: quantification of drosophila grooming behavior
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Drosophila Grooming Behavior at JoVE.com

Vi vill tacka Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon och Rose Hedreen för tidigt arbete vid testning och etablering av denna metodik och kammarmönster. Vi tackar Kelly Tellez och Graham Buchan för att läsa och redigera manuskriptet. Vi tackar Andrew Seeds och Julie Simpson för deras banbrytande arbete och deras råd och stöd för att föreslå användningen av Brilliant Yellow Dye (Sigma). Detta arbete stöds delvis av Mary E. Groff Kirurgisk och medicinsk forskning och utbildning Charitable Trust, Bronfman Science Center och Hellman Fellows Program.

1. Framställning <ol><li> Förbered en aspirator för att flytta levande Drosophila från en kulturflaska till vårdkammaren. Aspiratorer möjliggör överföring av medvetna djur till beteendeskammarna för att säkerställa att anestesi inte påverkar efterföljande beteendeobservation. <ol><li> Använda saxar skära 1,5 fot tygon tub ID ⅛ &quot;, OD ¼&quot;. Ta minst 1 tum av spetsen av en 1 ml engångs mikropipettspets. Håll ett 1 cm kvadratmaskintycke (öppnande 0,196 tum) över sku...

<ol>
	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster.">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Organization+and+Postural+Facilitation+-+Rules+for+Grooming+in+Flies.">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951 (2014).</li><li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila.">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li><li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100 (2011).</li><li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders.">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine.">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li><li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila.">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li><li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMB,+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies.">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li><li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines.">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li><li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+D1+family+dopamine+receptor,+DopR,+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila.">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li><li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

Grooming-analysen är relativt okomplicerad, men vi skulle försiktighetsexperimentärer att ägna särskild uppmärksamhet åt följande frågor. Underhåll av en tät försegling genom att dra åt skruvarna på topp- och bottenplattorna efter införandet av flugor och färgämnen är avgörande för reproducerbara resultat. Briljantgult färgämne är mycket bra och lösa leder leder till förluster av färgämne från kammarens kanter. Oregelbundenheten i färgämnesinnehållet för varje brunn kan enkelt slänga av ...

Grooming i Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) är ett robust medfödd beteende som innebär samordning av flera oberoende motorprogram 1 . Fruktflugor rengör sina kroppar av damm, mikrober och andra patogener som kan hämma normal fysiologisk funktion som syn och flygning, eller leda till betydande immunförsvar. Genom att känna och reagera på både mekanisk 2 och immunaktivering 3 , flyger flugor repetitivt sina ben ihop eller på en målinriktad kroppsregion tills den är tillräckligt ren och grooming fortskrider till en annan del av kroppen. Fluor utför groomrörelser i olika sträckor som i stor utsträckning förekommer i stereotypa mönster 1 , 4 . En beteendemässig hierarki blir uppenbar som groomsignaler prioriteras. Kretskort och aktivitetsmönster har identifierats i support oFa modell som grooming program högst upp i hierarkin förekommer först och undertrycka parallella signaler från områden av kroppen som prepareras därefter 5 . Högsta prioritet ges huvudet, sedan buken, vingarna och slutligen bröstkorgen 5 . Vårdprogrammet i D. melanogaster är ett idealiskt system för studier av neurala kretsar, modulatoriska molekylsignaler och neurotransmittorer. Till exempel, kompromiss av neurofibrominfunktion 6 , förlust av Drosophila fragile X mental retardationsprotein ( dfmr1 ) 7 och exponering för bisfenol A (BPA) 8 orsakar allvarligt grooming och andra beteenden som är analoga mot diskreta mänskliga symptom på neurofibromatos, ömtåliga X Syndrom och aspekter av autismspektrumstörningar och respekterande underskotts hyperaktivitetsstörning (ADHD). Grooming beteende kan också vara habituaTed differentiellt över mutantstammar 2 , utlåning detta motorprogram till studier av beteendets plasticitet. Bredden av neurologiska fenomen som kan modelleras av Drosophila kräver ett nytt komparativt tillvägagångssätt för att mäta flygens förmåga att gifta sig själva. Den kombinerade verkan av vesikulära monoamintransportörer och den relativa överflödigheten av dopamin och andra biogena aminer i kroppen har visat sig förmedla fruktflödesbekämpning 9 , 10 . Octopamin och dopamin stimulerar jämförbar hindleg grooming aktivitet i decapitated flugor, medan tyramin, föregångaren av oktopamin, också utlöser grooming i mindre utsträckning 7 . Fyra dopaminreceptorer har identifierats i D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;. Genom att använda groomanalysmetoden som beskrivs i detta protokoll bestämde vi en roll för typ I-familjen Dopamin Receptor DopR ( DopR, dDA1, dum ) i hindleg grooming behavior 15 . Grooming kan indirekt kvantifieras genom att titta på renhetsgraden genom vilken ett djur helt kan grooms efter att ha dammat hela kroppen med en markörfärg eller fluorescerande damm 5 , 16 . Återstoden av damm kvar på kroppen kan användas som en relativ markör för det övergripande beteendet. Dusty flyger efter att ha fått tillräckligt med tid för att brudgummen kan uppvisa ett specifikt underskott i grooming beteende. När grooming undersökningar har blivit mer omfattande har protokoll införlivat sådana metoder som avkapning för att lägga till farmakologiska behandlingar på nacke nerver 10 , taktil stimulering av borstburkar för att framkalla grooming respons 2 ,Och videoinspelning av beteende 15 . Direkt observation av grooming kan enkelt studeras med hjälp av visuell observation och manuell registrering av frekvens och varaktighet för specifika grooming-händelser 4 . Vi konstruerade en femton brunnskammare som kan byggas med en 3D-skrivare eller laserskärare, och ritningarna är tillgängliga för reproduktion 15 . Konstruktionen använder två sammanfogade centralplattor med öppningar som matchas och separeras av nät och två ytterligare glidande topp- och bottenplattor, från vilka flugor och / eller färgämnen är laddade. Efter att ha tillåtit dammiga flugor tid att gifta sig, deponerar vi dem i etanol för att solubilisera färgen och mäta absorptionen av denna lösning vid färgens våglängd. En plattläsare kan användas för flera parallella prover eller en enlässpektrofotometer kan användas för individuella prover. Denna metod minimerar felet som induceras av hantering och alLows för grooming analyser ska köras på en mindre, kostnadseffektiv skala. Denna metod är härledd och modifierad från de metoder som pioneered av Julie Simpson och Andrew Seeds, som använder större hushållskammare med värmeelement för temperaturkänsliga kretsmanipulationer 5 . Följande protokoll visar kvantifieringen av grooming av hela kroppen såväl som visar alternativa metoder för kvantifiering av färgämnesackumulering på enskilda kroppsdelar. Vi presenterar också data för jämförelsegrad mellan WT och DopR- mutanter, samt metoder för att beräkna ett enkelt prestationsindex för grooming beteende.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5229K54</td>
			<td>ID 1/8&#34;, OD 1/4&#34;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (1ml and 200ul)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-165, 24-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Screen, 2&#34; x 2.6&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9318T44</td>
			<td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Yellow Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201375-25G</td>
			<td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>set to &#34;touch&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>86-1282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10025-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20170-293</td>
			<td>tubes can be reused with successive assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>26014017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HTX Platereader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>need to download catalog to access product number</td>
			<td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; acrylic plastic</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8473K341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 nuts</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90257A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A199</td>
			<td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1/2&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A194</td>
			<td>the second plate from the top needs to be tapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-56 3/8&#34; flat head phillips machine screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91500A088</td>
			<td>these hold the two middle plates together</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.175&#34; ID, 1/4&#34; OD, 0.34&#34; aluminum pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92510A044</td>
			<td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&#160; These act as sheaths for the 1&#34; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of drosophila grooming behavior

Drosophila grooming beteende är ett komplext flerstegs lokomotoriskt program som kräver samordnad rörelse av både fötter och bakben. Här presenterar vi ett grooming-analysprotokoll och en ny kammardesign som är kostnadseffektiv och skalbar för små eller stora studier av Drosophila grooming. Fluor dammas över hela kroppen med Brilliant Yellow färgämne och ges tid för att avlägsna färgämnet från sina kroppar i kammaren. Fluor deponeras därefter i en bestämd volym etanol för att solubilisera färgen. Den relativa spektralabsorbansen av färgämne-etanolprover för preparerade versus ungromerade djur mäts och registreras. Protokollet ger kvantitativa data om färgämnesackumulering för enskilda flugor, vilket lätt kan medelvärdes och jämföras över prov. Detta gör att experimentella mönster lätt kan utvärdera grooming förmåga för mutant djurstudier eller kretsmanipulationer. Denna effektiva procedur är både mångsidig och skalbar. Vi visar wOrkflöde av protokollet och jämförande data mellan WT-djur och mutanta djur för Drosophila- typ I-dopaminreceptorn ( DopR ).

Grooming-analysen ger kvantitativ data för att bedöma beteendets prestanda baserat på den relativa återstoden av ackumulerat färgämne kvar på kroppens flugor efter en bestämd tid för mätning för grooming (30 min). Provbilder av den glidande beklädnadskammarutformningen och större steg i analysen framhävs i Figur 1 . Flyger aggregat en signifikant mängd färgämne från omedelbar dammning genom virvelbildning i närvaro av färgämne ( Figur 2d, 2e<...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Drosophila Grooming Behavior at JoVE.com

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Detta protokoll beskriver en skalbar individuell grooming assay teknik i Drosophila som ger robusta, kvantitativa data för att mäta grooming beteende. Metoden är baserad på att jämföra skillnaden i färgämnesackumulering på kropparna hos icke-preparerade mot preparerade djur under en viss tidsperiod.

Kvantificering av Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

The overall goal of this method is to measure the grooming behavior of Drosophila by quantifying and comparing the remainder of colored brilliant yellow dye on the body of the animals in groomed and ungroomed conditions. This method can help answer key questions in the field of neurobiology and behavioral genetics such as the coordination of fine locomotive skills and the associated molecular regulators and circuits. The main advantage is as of this technique, are that it's rapid, robust and easy to perform by many experimentalists and students at a variety of skill levels.Demonstrating this procedure will be Frankie Barradale, a student in my laboratory. To begin the experiment, prepare an aspirator to move live Drosophila from a culture vial to the grooming chamber. Using scissors, cut 1.5 feet of Tygon tubing.Cut at least one inch of the tip of a one milliliter disposable micro-pipette tip and hold the one centimeter square piece of mesh over the 196 inch opening of the cut tip. Snugly place a fresh, one milliliter micro-pipette tip over the mesh and cut tip to create a holding chamber for flies. Cut the extreme tip of the new micro-pipette tip to widen the opening enough to allow the passage of a single fly.The hole will roughly match the opening of the grooming chamber. Snugly fit the nested tips onto the end of the Tygon tubing. Push the tips into the tube to ensure a tight fit to allow for vacuum pressure.On the other end of the tubing, cut the tip of a 200 milliliter micro-pipette tip and fit the narrow cut end into the tubing to form the mouth side of the aspirator. To prepare dust aliquot tubes, weigh five milligrams of brilliant yellow dye on weighing paper. Pour the dust into a 8 milliliter micro-centrifuge tube and tightly close the cap.Next, to prepare ethanol tubes, pipette one milliliter of 100%ethanol into 15 milliliter micro-centrifuge tubes. Label the tubes, cap and save the ethanol tubes for completion of the grooming assay. Also include at least one blank sample with only one milliliter of ethanol without a fly for negative controls.Assemble each grooming chamber by screwing the sliding top plate with the smaller holes, but leaving the bottom plate with the larger holes removed for the addition of the dust. Place each necessary grooming chamber flat on a table with the top face-down. Load five milligrams of brilliant yellow dye aliquot into each chamber, by tapping the tube against the surface of the chamber above the desired well.Tap the chamber against the table to ensure that all the dust falls through the mesh to the top of the plate. Then screw the bottom plate onto each chamber, so the wider ends of the conical openings face outward and the holes do not rest over the wells. Secure the bottom plate tightly, so that it does not slide and release dye.Flip the chamber over and knock it flat against the table a few times so that the dust falls through the mesh to rest on the bottom plate. Slide the top plate of the chamber into the open positions that the small holes align with the 15 wells, allowing the introduction of flies into the individual wells. Load one fly into the mouth aspirator by gently sucking through one end of the aspirator as if using a straw.Deposit the flies by lightly blowing and directing the opening toward the target. After loading a well, slide the top plate so that the fly is trapped in the chamber and place tape over the opening of the well during the loading of the hole chamber, to prevent the fly's escape while loading the other wells. If multiple flies are aspirated into a single well, leave that opening uncovered until only one fly remains.After all of the necessary wells are filled with flies, flip the chamber so that the bottom plate is upward and the dust has the potential to coat the flies by falling through the mesh. Tightly secure the top and bottom plates by tightening the screws and vortex the chamber to dust the flies for four seconds. Knock the chamber, top plate face-down against the table twice, so that the dye falls through the other side.Then, flip the chamber over, top plate face-up and knock the chamber twice, to ensure dye settles on the floor of the bottom chamber, away from the fly, held in the top chamber. For control flies, which are not allowed to groom, immediately proceed to sample preparation. Rest the chamber flat on the table or countertop, with the top plate upward for 30 minutes to allow the flies to groom.Place the chamber in a noise vibration free space, to keep your environment constant for all grooming experiments. Keeping the chamber level with the top plate upward, gently unscrew the bottom plate and remove it from the chamber, taking care not to lose any dye. Place the chamber on a CO2 pad with low air flow until the flies are anesthetized.Unscrew the top plate from the chamber, carefully use forceps to grab a leg and remove one dusted fly from each chamber and deposit it in a 1.5 milliliter micro-centrifuge tube containing ethanol. Once each micro-centrifuge tube contains one fly, close the cap and invert the tubes three times to agitate and mix the solution of dye and ethanol. Incubate the tubes containing ethanol and flies for five hours at room temperature to ensure full removal of the dye from the fly into solution.After five hours, briefly vortex each tube for two seconds to ensure clearance of the dyes from the flies. Aliquot 50 microliters of the experimental 1.5 milliliter tube into a well of a 96 well plate, taking note of the location of each sample on the plate. Add 200 microliters of ethanol to dilute the sample five times to avoid sealing effects of heavily dusted flies or large grooming defects.Use a plate reader to analyze each sample at 397 nanometers. Record the sample through the plate reader and save the spreadsheet with the recording samples on the plate. We used this method to study DopR by comparing the grooming performance of a strong hypomorph and to null DopR mutants to a wild type strain.The DopR mutants retained significantly more dye than their wild type of rescued counterparts, indicating that the DopR mutants were less efficient at grooming behavior. In a parallel experiment of Rutabaga flies, mutants display the higher dye accumulation levels than DopR mutants, suggesting a significant role of DopR in grooming behavior. After watching this video, you should have a good understanding of how to handle flies for behavioral assays and also measure the grooming behavior.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Enstaka Sensillum Inspelningar i Insekter Drosophila melanogaster Och Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Samtidig Registrering av Kalcium Signaler från identifierade nervceller och Utfodring beteende Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Metoder för analys Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulering av Escape Beteende i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly-analys för födosöksbeteende i<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Enkel analys för kvantifiering av social Undvikande i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Färgning Insekter för Behavioral Analyser: den parningsbeteende hos bedövade<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Högupplöst Kvantifiering av Lukt styrd Beteende i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Använda<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Använda Linear Agarose kanaler att studera<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Genomsökning Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...