Name: tandem affinity purification of protein complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iv&#225;n D'Orso.

1. Células chapeamento <ol><li> Um dia antes da transfecção, placa de 3,5 x 10 6 células HEK293T em 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml estoque) por placa de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm pratos por experiência / condição para garantir a recuperação de proteína suficiente. NOTA: O número de placas tem que ser determinada para cada experiência / condição, que vai...

<ol>
	<li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-based+prediction+of+protein+function.">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li><li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes.">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li><li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+two-hybrid+system:+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system.">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li><li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coimmunoprecipitation+assay.">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes.">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li><li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-TEFb,+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II.">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li><li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb.">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li><li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation.">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li><li>Adelman, K., Lis, J. 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W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex:+Releasing+the+Pause.">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li><li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+repressor,+tetR,+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives,+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells.">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II.">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).</li><li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline.">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li><li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics.">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li><li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology.">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li><li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins:+the+PEST+hypothesis.">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li></ol>

O protocolo aqui descrito para a expressão e o isolamento de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas não se limita à caracterização bioquímica de tais conjuntos moleculares, mas também pode ser utilizado para a identificação de novos interactores e modificações pós-traducionais que poderia regular a sua função. A utilização de etiquetas de afinidade não se restringe ao que é mencionado neste protocolo; mas a experiência sugere que o uso de STREP como o primeiro passo AP aumenta sign...

<html> Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a regulação precisa de processos biológicos 1, e mais estudos sobre estas PPIs poder informar sobre a sua função 2. Várias abordagens têm sido desenvolvidos para o estudo e caracterização de IPP, bem como para a identificação de novo de novos componentes de proteínas reguladoras. Em 1989, Stanley Campos e colegas relataram a levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio 3. Esta abordagem permite a identificação imparcial e abrangente de interactianos (de caçar) para uma proteína definida de interesse (isca) em Saccharomyces cerevisiae. Para além da sua utilidade notável para a descoberta de IPP, o ensaio Y2H pode ser utilizado para caracterizar pares de proteínas em células de levedura, que define o mínimo de domínios interactuantes, e a identificação de mutações que abolem essas interacções. Ao modificar o ensaio Y2H, IPP também pode ser estudado em células de mamíferoclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Variações do ensaio Y2H (por exemplo, sistema de levedura de três híbridos) também pode ser aplicada ao estudo de proteínas e de ARN-ligante orgânico proteína-pequeno em células. Outra ferramenta utilizada para estudar os IPP num sistema homólogo é o ensaio de co-imunoprecipitação (co-IP) 5. Ao utilizar um anticorpo para imunoprecipitar uma proteína de interesse, o ensaio de co-IP permite aos investigadores monitorar IPP em células para diferentes condições ambientais e experimentais situações. A utilização de proteínas marcadas no epitopo (por exemplo, FLAG, Myc, estreptococos e HA, entre outros), a purificação por afinidade (AP) métodos facilitou o isolamento de proteínas a partir de misturas complexas de proteínas para vários ensaios a jusante, incluindo Western blot, coloração de prata , e análise enzimática. No entanto, nenhuma destas abordagens anteriores permitem o isolamento de grandes quantidades de complexos de proteínas para caracterização adicional in vitro incluindo umssays, descoberta de subunidades reguladoras por espectrometria de massa, e a identificação de modificações pós-traducionais. Uma versão melhorada do método de AP AP é chamado tandem (TAP), que é uma técnica de purificação para o estudo de IPP através da criação de uma proteína de fusão com dois epitopos que se purifica por meio de dois pontos de acesso subsequentes 6, 7. Neste artigo, apresentamos uma variação do método TAP para complexos de proteína de purificação em que duas subunidades são marcadas com epítopos diferentes e depois purificado através de dois APs sequenciais (STREP AP seguido por FLAG IP). Em primeiro lugar, proporcionar uma visão minimalista da TAP (Figura 1) e, em seguida, uma descrição detalhada de todas as etapas experimentais (Figura 2), de modo que os investigadores possam aplicá-las a seu complexo de proteína de interesse. Para demonstrar a aplicabilidade do método de TAP, nós escolhemos um bem caracterizado ciclina-CDK complexa (referido como PTEFB quinase), que é composta da subunidade reguladora da ciclina T1 (CycT1) e uma cinase (CDK9), e está envolvido na regulação da transcrição por ARN-polimerase II (pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila o domínio C-terminal de pol II e os seus associados factores de alongamento negativos, o que alivia a pausa da transcrição no promotor e facilita assim a transcrição de alongamento 11, 12, 13. Com essa interação conhecida em mente, STREP-marcado CycT1 e CDK9 marcado com FLAG foram mais expressos em células HEK293T. Uma experiência recíproca TAP foi realizada com CDK9 marcaram-STREP e marcado com FLAG CycT1 para validar ainda mais que a interacção da proteína é independente dos epítopos utilizados. As células foram recolhidas e lisadas 48 h após a transfecção. O ligado solúvel foi purificado por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada e proteínas purificadas foram analisadas por Western blot e por coloração com prata (Figura 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30022FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP091670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-478-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STREP-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1208-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STREP-tag elution buffer</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBQ1981V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100mm &#215; 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 hole micro tube foam rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake shaker rotisserie&#160;</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>415110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem affinity purification of protein complexes from eukaryotic cells

A purificação dos complexos de ácido nucleico de proteína-proteína-proteína activa e é essencial para a caracterização das actividades enzimáticas e de identificação de novo de novas subunidades e as modificações pós-traducionais. sistemas bacterianos para permitir a expressão e purificação de uma grande variedade de polipéptidos simples e complexos de proteínas. No entanto, este sistema não permite a purificação de subunidades proteicas que contêm modificações pós-translacionais (por exemplo, fosforilação e acetilação), e a identificação de novas subunidades reguladoras que estão apenas presentes / expressas no sistema eucariota. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um romance, robusta e eficiente método de purificação de afinidade em tandem (TAP), utilizando Streptomyces e proteínas marcada com Flag que facilita a purificação de complexos de proteínas com proteínas marcadas no epitopo transiente ou estavelmente expresso a partir de células eucarióticas. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar Protein funcionalidade complexa, para descobrir modificações pós-translacionais sobre subunidades complexas, e para identificar novos componentes complexos de regulação por espectrometria de massa. Notavelmente, este método TAP pode ser aplicado para estudar complexos proteicos formados por componentes eucarióticas ou patogénicos (viral e bacteriana), obtendo-se assim uma grande variedade de oportunidades experimentais jusante. Propomos que os investigadores que trabalham com complexos de proteína poderia utilizar esta abordagem de muitas maneiras diferentes.

Neste artigo, demonstrar a aplicabilidade do método de TAP para o bem caracterizado CycT1-CDK9 complexo (também conhecida como P-TEFb quinase). Os plasmídeos que codificam ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabela 1), foram transfectados em células HEK293T . Os controlos negativos incluíram as transfecções com um vector vazio e o CDK9...

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

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