Name: tandem affinity purification of protein complexes from eukaryotic cells
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iv&#225;n D'Orso.

1. utstrykning av celler <ol><li> En dag före transfektion, plattan 3,5 x 10 6 HEK293T-celler i 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin (10.000 U / ml lager) per 100 mm skål. Plate 3 - 5 100 mm skålar per experiment / skick för att säkerställa tillräcklig proteinutvinning. OBS: Antalet plattor måste bestämmas för varje experiment / skick, vilket kommer att förlita sig på...

<ol>
	<li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-based+prediction+of+protein+function.">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li><li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes.">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li><li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+two-hybrid+system:+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system.">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li><li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coimmunoprecipitation+assay.">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes.">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li><li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-TEFb,+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II.">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li><li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb.">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li><li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation.">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li><li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II:+emerging+roles+in+metazoans.">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li><li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=7SKiing+on+chromatin:+move+globally,+act+locally.">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li><li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex:+Releasing+the+Pause.">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li><li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline+repressor,+tetR,+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives,+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells.">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li><li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II.">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).</li><li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline.">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li><li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics.">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li><li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology.">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li><li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins:+the+PEST+hypothesis.">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här för uttryck och isolering av proteinkomplex från eukaryota celler är inte begränsad till den biokemiska karakteriseringen av sådana molekylära aggregat, men kan även utnyttjas för identifiering av nya Interactmedlemmar och posttranslationella modifieringar som skulle kunna reglera deras funktion. Användningen av affinitetsmarkörer inte är begränsad till vad som anges i detta protokoll; men vår erfarenhet tyder på att användning av STREP som den första AP steget signifikant f...

<html> Protein-proteininteraktioner (PPI) är avgörande för exakt reglering av biologiska processer 1, och ytterligare studier på dessa PPI kan informera om deras funktion 2. Flera tillvägagångssätt har föreslagits för att studera och karakterisering av protonpumpshämmare såväl som för identifiering av nya regulatoriska proteinkomponenter de novo. 1989, Stanley Fält och kollegor rapporterade jäst två-hybrid (Y2H) analys 3. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att det ej förspända och omfattande identifiering av Interactmedlemmar (bytesorganismer) för ett definierat protein av intresse (bete) i Saccharomyces cerevisiae. Utöver sin anmärkningsvärda verktyg för att upptäcka PPI kan Y2H analysen användas för att karaktärisera protein par i jästceller, som definierar minimala samverkande domäner, och identifiera mutationer som avskaffar sådana interaktioner. Genom att modifiera Y2H analys kan protonpumpshämmare också studeras i däggdjurscellerclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Variationer av Y2H analysen (t.ex., jäst tre-hybridsystemet) kan också tillämpas för att studera protein-RNA och protein-små organiska ligand interaktioner i celler. En annan vanligt förekommande verktyg för att studera protonpumpshämmare i en homolog systemet är co-immunoprecipitation (co-IP) -analys 5. Genom användning av en antikropp för att immunfälla ett protein av intresse, tillåter samtidig IP-analysen forskare att övervaka PPI i celler för olika miljöförhållanden och experimentella situationer. Användningen av epitopmärkta proteiner (t.ex. FLAG, Myc, STREP och HA, bland andra) i affinitetsrening (AP) metoder har underlättat isolering av proteiner från komplexa proteinblandningar under flera nedströms analyser, inklusive western blöt, silverfärg , och enzymatisk analys. Men ingen av dessa tidigare tillvägagångssätt gör det möjligt för isolering av stora mängder av proteinkomplex för ytterligare karakterisering inklusive in vitro enssays, upptäckten av regulatoriska underenheter genom masspektrometri, och identifiering av posttranslationella modifieringar. En förbättrad version av AP metoden kallas Tandem AP (TAP), som är en reningsteknik för att studera protonpumpshämmare genom att skapa ett fusionsprotein med två epitoper som renas genom två efterföljande AP 6, 7. I den här artikeln presenterar vi en variant av TAP förfarande för rening av proteinkomplex i vilka två subenheter är märkta med olika epitoper och sedan renas genom två sekventiella APS (STREP AP följt av FLAG IP). Vi tillhandahåller först en minimalistisk översikt av TAP (figur 1) och därefter en detaljerad beskrivning av alla de experimentella stegen (Figur 2), så att forskare kan använda dem till deras proteinkomplex av intresse. För att demonstrera tillämpbarheten av TAP-metoden, valde vi en välkarakteriserad cyklin-CDK-komplex (kallas PTEFB-kinas), vilken är sammansatt av den regulatoriska subenheten cyklin T1 (CycT1) och en kinas (CDK9), och är involverad i regleringen av transkription genom RNA-polymeras II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforylerar den C-terminala domänen av Pol II och dess associerade negativa elongeringsfaktorer, som befriar transkriptionspaus vid promotorn och därigenom underlättar transkription töjning 11, 12, 13. Med denna kända interaktion i åtanke, STREP-märkta CycT1 och FLAG-märkt CDK9 var överuttryckt i HEK293T celler. En reciprok TAP experiment utfördes med STREP-taggade CDK9 och FLAG-märkt CycT1 att ytterligare validera att interaktionen proteinet är oberoende av de epitoper som används. Celler uppsamlades och lyserades 48 h efter transfektion. Det lösliga lysatet renades genom TAP (STREP AP följt av FLAGIP). Ingång och renade proteinerna analyserades genom western blöt och silverfärgning (figur 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30022FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP091670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-478-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STREP-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1208-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STREP-tag elution buffer</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBQ1981V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100mm &#215; 20 mm style Dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 hole micro tube foam rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake shaker rotisserie&#160;</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>415110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem affinity purification of protein complexes from eukaryotic cells

Reningen av aktivt protein-protein och protein-nukleinsyrakomplex är avgörande för karakterisering av enzymatiska aktiviteter och de novo identifiering av nya subenheter och posttranslationella modifieringar. Bakteriella system tillåter för uttryck och rening av ett brett utbud av enstaka polypeptider och proteinkomplex. Men detta system inte möjliggör rening av proteinunderenheter som innehåller post-translationella modifieringar (t.ex. fosforylering och acetylering), och identifiering av nya regulatoriska underenheter som bara före / uttryck i eukaryota systemet. Här ger vi en detaljerad beskrivning av ett nytt, robust och effektiv tandem affinitetsrening (TAP) metod som använder STREP- och FLAG-taggade proteiner som underlättar reningen av proteinkomplex med gående eller stabilt uttryckte epitopmärkta proteiner från eukaryota celler. Detta protokoll kan användas för att karakterisera protein komplex funktionalitet, att upptäcka posttranslationella modifieringar på komplexa subenheter, och att identifiera nya reglerings komplexa komponenter med masspektrometri. Noterbart kan detta TAP metod användas för att studera proteinkomplex som bildas av eukaryota eller patogena (virus- och bakterie) komponenter, vilket således ger ett brett spektrum av nedströms experimentella möjligheter. Vi föreslår att forskare som arbetar med proteinkomplex kan utnyttja denna metod på många olika sätt.

I denna artikel, visar vi tillämpbarheten av TAP metoden till den välkarakteriserade CycT1-CDK9 komplex (även känt som P-TEFb kinas). Plasmider som kodar cyklin T1-STREP (CycT1: S) och CDK9-FLAG (CDK9: F), eller CDK9-STREP (CDK9: S) och Cyklin T1-FLAG (CycT1: F) (tabell 1), transfekterades in i HEK293T-celler . Negativa kontroller inkluderade transfektioner med en tom vektor och CDK9: F eller CycT1: F-plas...

Watch this Scientific Journal Video about Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering av besläktade RNA-proteinkomplex från celler med användning av oligonukleotid-riktad Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

En oligonukleotid-baserade Tandem RNA isolering förfarande att återställa eukaryota mRNA-proteinkomplex

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rening av kloroplast Translocon proteinkomplex med taggen TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttryck, lösbarhet och rening av eukaryota Borat transportörer

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extrahera modifierade mikrotubuli från däggdjursceller för att studera mikrotubuli-proteinkomplex med kryoelektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...