Name: analysis of chromosome segregation, histone acetylation, and spindle morphology in horse oocytes
Uploaded: 2017-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا فابريس فنسنت على الدعم الذي قدمه مع المسح الضوئي المجهري البؤري بالليزر (لم) ، وفليب بارير وتييري بلارد لأداء المسح المبيض بالموجات فوق الصوتية يوميا وحقن قوات حرس السواحل الهايتية. وأيد هذا العمل جزئيا مشروع &quot;ريجيون سارديغنا أند ريجيون لومبارديا&quot; &quot;إكس أوفو أومنيا&quot; (المنحة رقم 26096200 إلى مكافحة غسل الأموال). (العقد 2012 إلى فف)، FP7-بيوبل-2011- سيغ، الوكالة التنفيذية للبحوث (ريا) &quot;برو-أوفوم&quot; (المنحة رقم 303640 إلى فل)، و FP7-بيوبل-2011- سيغ. ومدرسة ما بعد الدكتوراه في الزراعة والطب البيطري، بتمويل مشترك من الصندوق الاجتماعي الأوروبي، البرنامج التشغيلي القطاعي لتنمية الموارد البشرية للفترة 2007-2013 (العقد رقم بوسدرو / 89 / 1.5 / S / 62371 إلى إدارة المعلومات). تم تمويل جمع البويضات في الجسم الحي من قبل معهد فرانسيس دو تشيفال إت دي l&#39;إكيتاتيون.

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامها سييا فال دي لوير رقم 19 وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. جمع البويضات والنضج في المختبر <ol style=";text-align:right;directio...

<ol>
	<li>Dellenbach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvaginal,+sonographically+controlled+ovarian+follicle+puncture+for+egg+retrieval.">Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval.</a> Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).</li><li>Humaidan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome:+review+and+new+classification+criteria+for+reporting+in+clinical+trials.">Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials.</a> Hum Reprod. , (2016).</li><li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+in+Vivo+and+in+Vitro+:+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs.">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li><li>Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+maturation+and+subsequent+delayed+fertilization+is+associated+with+increased+embryo+aneuploidy.">In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy.</a> Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).</li><li>Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vitro+maturation+and+age+on+oocyte+quality+in+the+rhesus+macaque+Macaca+mulatta.">Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta.</a> Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).</li><li>Requena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+in-vitro+maturation+of+oocytes+on+aneuploidy+rate.">The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate.</a> Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).</li><li>Franciosi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+affects+chromosome+segregation,+spindle+morphology+and+acetylation+of+lysine+16+on+histone+H4+in+horse+oocytes.">In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes.</a> Reprod Fertil Dev. , (2015).</li><li>Franciosi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+histone+H4+acetylation+during+in+vivo+versus+in+vitro+maturation+of+equine+oocytes.">Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).</li><li>Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+medium+variations+(zinc+supplementation+during+oocyte+maturation,+perifertilization+pH,+and+embryo+culture+protein+source)+on+equine+embryo+development+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Hendriks, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+and+in+vitro+culture+affect+mitochondrial+number+and+function+in+equine+oocytes+and+embryos.">Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).</li><li>Carnevale, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mare+model+for+follicular+maturation+and+reproductive+aging+in+the+woman.">The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman.</a> Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).</li><li>Ginther, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mare:+a+1000-pound+guinea+pig+for+study+of+the+ovulatory+follicular+wave+in+women.">The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women.</a> Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes.">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li><li>Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+defective+spindle+assembly+checkpoint+is+not+the+primary+cause+of+maternal+age-associated+aneuploidy+in+mouse+eggs.">Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs.</a> Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).</li><li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing.">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).</li><li>Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+of+equine+oocytes+collected+by+follicle+aspiration+and+by+the+slicing+of+ovaries.">In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries.</a> Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inadequate+histone+deacetylation+during+oocyte+meiosis+causes+aneuploidy+and+embryo+death+in+mice.">Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).</li><li>Homer, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).</li><li>Rambags, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+chromosomal+abnormalities+in+equine+embryos+produced+in+vivo+and+in+vitro.">Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro.</a> Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).</li><li>Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-mode+regulation+of+the+APC/C+by+CDK1+and+MAPK+controls+meiosis+I+progression+and+fidelity.">Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity.</a> J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).</li><li>Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+establishment+is+defective+in+oocytes+from+aged+mice.">Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice.</a> Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).</li><li>Luzzo, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+induced+developmental+defects+in+the+mouse:+oocyte+meiotic+aneuploidy+and+fetal+growth+retardation/brain+defects.">High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects.</a> PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).</li><li>Ma, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+(HDAC2)+regulates+chromosome+segregation+and+kinetochore+function+via+H4K16+deacetylation+during+oocyte+maturation+in+mouse.">Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).</li><li>Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hyperacetylation+during+meiosis+interferes+with+large-scale+chromatin+remodeling,+axial+chromatid+condensation+and+sister+chromatid+separation+in+the+mammalian+oocyte.">Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).</li><li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B.">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).</li><li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation,+fertilization,+and+early+embryonic+development.">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li><li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis.">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li><li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time.">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse.">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).</li></ol>

على الرغم من أن إيفم قد أجريت في الخيول لأكثر من 20 عاما 16 ، ونحن لا نعرف حتى الآن ما إذا كان البويضة يمكن أن يكون أصل أنيوبلوادي الغدة الجنينية، كما اقترح للبشر 17 . والسبب هو على الأرجح أن إعداد ينتشر البويضة لنتائج العد الكروموسوم في فقدان عي?...

وقد تم تطوير مجموعة واسعة من تقنيات المساعدة على الإنجاب لعلاج العقم لدى النساء والحيوانات المصاحبة والأنواع المهددة بالانقراض. واحدة من الإجراءات الأكثر شيوعا في البيئات السريرية هو استرجاع الطور الثاني (مي) البويضات -stage من الجريبات المبيض عن طريق الموجات فوق الصوتية الموجهة المهبل المهبل، البيضاوي البيك اب (أوبو) 1 . ثم يتم تسميد هذه البويضات في المختبر (إيف)، مع الجنين الناتجة (ق) زرعها في الرحم المستلم. يتم استرجاع البويضات مرحلة مي (ناضجة) بعد إدارة الغدد التناسلية الخارجية. ومع ذلك، يرتبط هذا العلاج، في بعض المرضى، مع تطور متلازمة فرط المبيض (أوهس) 2 . الاستفادة من القدرة الذاتية من نمت بشكل كامل، البويضات غير ناضجة (GV- مرحلة) لاستئناف عفوية الانقسام الاختزالي مرة واحدة معزولة عن بصيلاتهم، فمن الممكن الحصول على البويضات ناضجة دون أدمينيستيرون الغدد التناسلية 3 . ويسمى هذا الإجراء البويضات في النضج المختبر (إيفم) ويمثل أقل موجهة نحو المخدرات، وأقل تكلفة، وأكثر ملاءمة للمريض نهج لمساعدة التكنولوجيا الإنجابية. ومع ذلك، فإن نجاح تطوير الجنين مع البويضات في المختبر -matured أقل عموما من مع في الجسم الحي نضجت البويضات 4 ، 5 . تفسير محتمل هو أن في المختبر نضجت البويضات هي أكثر تضررا من الأخطاء في الفصل الكروموسوم، و أنيوبلوادي يؤدي إلى إعاقة التطور الجنيني الطبيعي 6 . وفهم الأساس الجزيئي من الكروموسومات سوء الفصل أثناء إيفم الكشف في نهاية المطاف عن الإمكانات الكاملة لهذه التقنية. في هذا السياق، استخدم المنهج التجريبي للتحقيق في السمات المورفولوجية والبيوكيميائية للبويضات في المختبر -mureded، مقارنة مع في الجسم الحي نضجيتم وصف البويضات إد هنا 7 ، 8 . على وجه التحديد، يتم توضيح إجراءات ل أوبو من البويضات غير ناضجة وناضجة و إيفم من البويضات غير الناضجة باستخدام الخيول الكبار والطبيعة بشكل طبيعي كنموذج تجريبي. ثم، يتم استخدام المناعي وتحليل الصورة للتحقيق الكروموسوم الفصل، مورفولوجيا المغزل، والنمط العالمي من أستيون هيستون على هذه غاميتس. وأخيرا، وصف بروتوكول من النسخ العكسي وكمية ير لتحليل التعبير مرنا. وبالمقارنة مع النماذج الحيوانية القوارض، والخيول لا تسمح التلاعب الجيني، هي أقل سهولة للتلاعب، وتتطلب صيانة باهظة الثمن. ومع ذلك، فإن هذا النموذج يكتسب اهتماما كبيرا لدراسة النضج البويضة 9 ، 10 بسبب تشابه لعلم وظائف الأعضاء المبيض الإنسان 11 ، 12 &lt;/ سوب&gt;. وعلاوة على ذلك، فإن وضع بروتوكولات موثوقة من إيفم-إيف في الحصان له مصلحة اقتصادية كبيرة، لأنها تسمح لزيادة في عدد من المهرات من الفرس من القيمة الجينية العالية. واحدة من القيود المفروضة على إجراء التجارب على البويضات، وخاصة في الأنواع أحادي، هو توافر عينة مقيدة. وقد تم التغلب على هذا الحد هنا عن طريق تعديل نهج، وضعت سابقا في الفئران، لبويضات الحصان 13 ، 14 من أجل إجراء العد الكروموسوم الذي يقلل من فقدان العينة (انظر المناقشة للمقارنة مع التقنيات المتاحة الأخرى). وعلاوة على ذلك، تم تحسين بروتوكول تلطيخ الثلاثي مضان لإجراء تحليلات متعددة على نفس العينة، وأجريت التحليلات q- ير على برك من 2 البويضات فقط. وعموما، فإن هذه الدراسة تصف نهجا تجريبيا يهدف إلى تشورفيا و تشيميا كيميائياراكتريز البويضة الحصان، وهو نوع من الخلايا التي هي صعبة للغاية للدراسة بسبب توفر عينة منخفضة. ومع ذلك، فإنه يمكن توسيع معرفتنا في البيولوجيا التناسلية والعقم من الأنواع أحادي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">ultrasound probe</td>
			<td style="width:159px;">Aloka</td>
			<td style="width:113px;">UST-5820-7,5</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human chorionic gonadotrophin&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>CHO004</td>
			<td>1500unit/animal IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">detomidine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>MED010</td>
			<td>9-15&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butylscopolamine bromure&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>EST001</td>
			<td>0,2mg/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:159px;">NIKON</td>
			<td style="width:113px;">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butorphanol</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DOL003</td>
			<td>10&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzyl-penicillin</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DEP203 IM</td>
			<td>15000UI/animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3769 10X1L</td>
			<td>powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3-buffered TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2154-500ML</td>
			<td>liquid for IVM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epidermal growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">newborn calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dishes</td>
			<td>NUNCLON</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>BB6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">monastrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">normal donkey serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>636102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vecta-Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">YOPRO1</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Y3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 780&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 700&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td colspan="2">rsb.info. nih.gov/ij/download.html&#160;</td>
			<td>free resource</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti-alpha-tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-acH4K16</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>07-329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNALater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferase RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PicoPure RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">random hexamers&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>N8080127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green supermix&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">specific primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermal-cycler&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MyiQ&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-CENPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-Aurora B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3609</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of chromosome segregation, histone acetylation, and spindle morphology in horse oocytes

وقد تم تطوير مجال المساعدة على الإنجاب لعلاج العقم لدى النساء والحيوانات المصاحبة والأنواع المهددة بالانقراض. في الحصان، كما يسمح الاستنساخ بمساعدة لإنتاج الأجنة من الأداء العالي دون انقطاع حياتهم الرياضية ويسهم في زيادة في عدد من المهرات من الفرس ذات القيمة الوراثية العالية. يصف المخطوطة الحالية الإجراءات المستخدمة لجمع البويضات غير الناضجة والناضجة من المبيض الحصان باستخدام البيضة البيك اب (أوبو). ثم استخدمت هذه البويضات للتحقيق في حدوث أنيوبلوادي عن طريق تكييف بروتوكول وضعت سابقا في الفئران. على وجه التحديد، كانت الكروموسومات و سينتروميرس من الطور الثاني البويضات (مي) فلورزنتلي المسمى وتحسب على خطط التنسيق متتابعة بعد متحد البؤر المجهر ليزر المسح الضوئي. وكشف هذا التحليل عن حدوث أعلى في معدل أنيوبلوادي عندما تم جمع البويضات غير ناضجة من المسام ونضجت في المختبر مقارنة معفي الجسم الحي. المناعية للأنبوبين وشكل أستيل من هيستون أربعة في مخلفات يسين محددة كشفت أيضا الاختلافات في مورفولوجيا المغزل الانتصافي وفي النمط العالمي من أستيون هيستون. وأخيرا، تم التحقيق في التعبير عن ترميز مرناس لهستون ديستيلاسيس (هداس) وأسيتيل-ترانسفاسيس (هاتس) عن طريق النسخ العكسي والكمي ير (ف ير). لم تلاحظ أي اختلافات في التعبير النسبي للنصوص بين في المختبر وفي الجسم الحي نضجت البويضات. في اتفاق مع إسكات العام للنشاط النسخي خلال النضج البويضة، وتحليل مجموع المبلغ نص يمكن أن تكشف فقط استقرار مرنا أو تدهور. ولذلك، فإن هذه النتائج تشير إلى أن الأنظمة الأخرى متعدية وبعد متعدية قد تتأثر. وعموما، فإن هذه الدراسة تصف نهجا تجريبيا ل مورفولوجيا و بيوشيميكالي وصف بويضة الحصان، و سيليرة لبنانية نوع من الصعب للغاية لدراسة بسبب انخفاض توافر عينة. ومع ذلك، فإنه يمكن توسيع معرفتنا على البيولوجيا التناسلية والعقم في الأنواع أحادي.

تم وصف النتائج الأصلية لهذه التجارب في العمق سابقا 7 ويتم الإبلاغ عنها هنا كمثال على النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام البروتوكولات وصفها. معدل النضج <p class="jove_content" fo:keep-together....

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes at JoVE.com

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

تصف هذه المخطوطة نهجا تجريبيا لتوصيف البويضات الحصانية شكليا وبيولوجيا كيميائيا. على وجه التحديد، ويوضح العمل الحالي كيفية جمع البويضات الحصان غير ناضجة وناضجة عن طريق الموجات فوق الصوتية الموجهة البيك البيك اب (أوبو) وكيفية التحقيق الفصل الكروموسوم، مورفولوجيا المغزل، هيستون العالمية هيستيون، والتعبير مرنا.

تحليل فصل الكروموسوم، هيستون أستيلاتيون، و مورفولوجيا المغزل في البويضات الحصان

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

The overall goals of this experimental approach are to, first, morphologically and biochemically characterize horse oocytes and, second, to compare gametes from the same animal that were processed in vitro or in vivo. This experimental approach can help answer key questions in oocyte biology and fertility in monovulatory species. It might also improve the safety of gamete manipulation procedures.This approach was developed to overcome the restricted sample availability of oocytes, especially from monovulatory species. Demonstrating the OPU procedures will be Professor Stefan Deleuze of the University of Liege, Cecile Douet, the lab manager of my lab, and Fabrice Reigner, the manager of the equine unit at the INRA Centre Val de Loire. On a daily basis, assess the diameter of the ovarian follicles in a cohort of adult mares using ultrasound.Search for a large follicle with a diameter greater than 33 millimeters. Once found, prepare to inject 1, 500 units of human chorionic gonadotropin to induce the maturation of the oocyte into a dominant follicle. Next, locate the jugular furrow, and swab the injection site with alcohol.Then, to make the vein rise, apply some force two or three centimeters below the site of injection. Insert the needle almost parallel to the neck, aspirate slightly to ensure that the needle is in the vein, and inject the hormone. Prepare an ultrasound probe for vaginal access.Then, connect the needle to a suction system. 35 hours after hCG injection, set up the instrumentation for OPU, and sedate the mare. Good analgesia is extremely important for the animal's and the operator's safety.An animal that does not feel pain or discomfort will allow manipulation of the ovary, making punctures and flushes easier to perform. Once the needle probe is inserted, one operator must manipulate the ovary to face the probe while the other operator manipulates the needle. Locate the dominant follicle in the echographic image.Then, use the needle to pierce the vaginal wall and the wall of the dominant follicle. Once the follicle space is accessed, aspirate the follicular fluid. Rotate the needle to scrape the follicular wall and attach the cumulus-oocyte complex.Then, pour the fluid into a large petri dish. And under a stereoscope, search for the COC. Meanwhile, flush out the follicle with warm Dulbecco's modified PBS containing heparin.It may take several flushes to collect the COC. After the COC is found, change the needle to a double-lumen needle and collect the immature COCs from all of the follicles that are between five and 25 millimeters in diameter. These will be used for in vitro maturation.Once all of the follicles from one ovary are aspirated, repeat the same procedures to collect the immature COCs from the other ovary. Now, choose between the COCs. Keep only COCs with several complete layers of cumulus cells and a brown, finely-granulated ooplasm.Discard the others. At the end of the procedure, inject the mare with 15, 000 units of benzyl-penicillin to prevent infection. Then, house the mare in a quiet, clean stable for at least two hours while she recovers.Before the OPU starts, warm a bottle of supplemented HEPES-buffered TCM-199 to 37 degrees Celsius. Next, prepare the IVM medium. Dispense 500 microliters of supplemented sodium bicarbonate-buffered TCM-199 into the wells of a four-well dish.Then, incubate the dish at 38.5 degrees Celsius for at least two hours. Transfer the recovered immature COCs to a 3.5-centimeter dish filled with two milliliters of the warmed HEPES TCM-199. Move the COCs through different regions of the dish to gently wash away surrounding debris.Now, transfer the COCs to the IVM medium, and incubate them for 28 hours at 38.5 degrees Celsius. To perform a chromosome count on mature COCs, incubate them in 100-micromolar monastrol for an hour at 38.5 degrees Celsius. Next, remove the cumulus cells by treating the COCs with 0.5%hyaluronidase in HEPES-buffered TCM-199.Monitor this reaction on a heated stage set to 38 degrees Celsius. Within about five minutes, remove all of the cells. Use gentle pipetting to remove the last few stubborn cells.Next, remove the zona pellucida using 0.2%pronase in HEPES-buffered TCM-199. Monitor this reaction on a heated stage as well. It should take about five minutes to complete.Then, fix the oocytes in 4%paraformaldehyde in DPBS for 15 minutes at 38.5 degrees Celsius, followed by 45 more minutes of fixation at four degrees Celsius. After the fixation, wash the oocytes by sequentially transferring them between three wells of 0.1%polyvinyl alcohol in DPBS. Use about half a milliliter of solution per well.Then, transfer the oocytes to a well filled with 0.3%Triton X-100 in PBS, and let them incubate for 10 minutes at room temperature. To block non-specific signals, bathe the cells in DPBS with 1%BSA and 10%normal donkey serum. Incubate the cells for at least 30 minutes at room temperature.After 30 minutes, apply the primary antibody, and then incubate the cells at four degrees Celsius overnight. The following day, wash the oocytes, and apply the secondary antibody for an hour at room temperature, shielded from light exposure. After applying the secondary, wash the oocytes again.Then, before mounting, attach double-sided tape strips to slides to serve as coverslip supports. Now, mount the oocytes three to four per slide in a drop of non-hardening, antifade mounting medium supplemented with 20 micromolar of YO-PRO-1. Allow the oocytes to settle for about 10 minutes, and then apply the coverslips.Out of 32 COCs retrieved by OPU from dominant follicles, 28 were in metaphase II.Using in vitro maturation, 37 of 44 COCs collected from non-dominant follicles were matured to metaphase II.The chromosomes of both groups were then compared. The in vitro-matured oocytes were often affected by aneuploidy, mostly hyperploidy. This was not observed in the in vivo-matured oocytes.Next, the pole-to-pole spindle length and the diameter of the spindle at its maximum were both measured. The in vitro-matured oocytes were significantly longer and wider than the in vivo-matured oocytes. In the same samples, the global acetylation level of H4K16 was measured.The results were as expected. Acetylation of H4K16 was significantly lower in in vitro-matured oocytes than in in vivo-matured oocytes. A well-trained team can process five mares in a morning of OPU with an 80%retrieval rate for the preovulatory oocyte and 50 to 60%retrieval of the immature oocytes.During the OPU, always monitor the ess and well-being of the animal, and be ready to provide adequate veterinary care if needed. The experimental approach can be applied to oocytes of other species as well and is especially applicable where samples availability is an issue, such as with humans. Based on our results, studies must be undertaken to better understand the culture conditions needed for proper chromosome segregation and epigenetic changes.The overarching goal is to improve in vitro maturation efficiency for both veterinary medicine and human fertility treatment.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Reproduction and Development

SCIENTISTS IN ACTION

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

التعبير عن البروتينات الفلورية في<em&gt; السهيم</em&gt; من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من خلال ميكروينجكتيون من البويضات

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

الحد الأدنى من حجم الحساسية من البويضات غير ناضجة القطط

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

في استراتيجية ثقافة فيترو لبويضات من أوائل الجريب الأنترال في الماشية

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...