Name: efficient differentiation of pluripotent stem cells to nkx6-1+ pancreatic progenitors
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors at JoVE.com

यह पांडुलिपि से टोरंटो जनरल और पश्चिमी फाउंडेशन और बैंटिंग और बेस्ट मधुमेह केन्द्र-विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क ग्रेजुएट पुरस्कार धन के द्वारा समर्थित किया गया।

1. समाधान और मीडिया की तैयारी ध्यान दें: एक बाँझ वातावरण में सेल संस्कृति के लिए सभी मीडिया तैयार करें। मीडिया बना दिया और तुरंत इस्तेमाल किया जा रहा है। अभिकर्मक विवरण सामग्री तालिका म...

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	<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes.">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro.">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li><li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo.">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice.">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li><li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm.">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li><li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice.">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li><li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li><li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors.">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis.">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li><li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas.">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li><li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures.">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li><li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li><li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).</li></ol>

सफलतापूर्वक इन विट्रो में hPSCs से NKX6-1 + अग्नाशय पूर्वज पैदा hPSCs की उच्च गुणवत्ता संस्कृतियों और निर्देशित भेदभाव विशिष्ट संकेत दे रास्ते कि अग्नाशय के विकास के दौरान महत्वपूर्ण विकास के चरणों शास?...

मधुमेह का प्रसार बढ़ता जा रहा है और कनाडा डायबिटीज एसोसिएशन के अनुसार, यह अनुमान लगाया गया है कनाडा में 11 लाख से अधिक व्यक्तियों मधुमेह या prediabetic हैं कि इन होने टाइप 1 मधुमेह (T1D) 1 व्यक्तियों के 5-10% के साथ। T1D एक autoimmune रोग है कि इंसुलिन के उत्पादन β कोशिकाओं है कि आइलेट्स की आइलेट्स के भीतर स्थित हैं के विनाश के कारण होता है। वर्तमान में, T1D साथ रहने वाले व्यक्तियों इंसुलिन 2 की बहिर्जात स्रोतों की आवश्यकता है। इंसुलिन चिकित्सा के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, T1D रोगियों के लिए एक मुश्किल समय उनके रक्त में शर्करा की मात्रा को विनियमित करने के लिए है और दोनों hypo- और hyperglycemia ग्रस्त करने के लिए जारी रखने के लिए जारी है। उपचार का एक होनहार प्रपत्र बहाल करने के लिए T1D में normoglycemia मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) है, जो दोनों vivo में इन विट्रो 3 में β कोशिकाओं का उत्पादन इंसुलिन की एक असीमित की आपूर्ति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का इस्तेमाल होता है, <sअप वर्ग = &quot;xref&quot;&gt; 4, 5, 6, 7। HESCs फर्क बीटा-तरह के लिए कोशिकाओं यह संभव इन विट्रो में मधुमेह का अध्ययन, टाइप 2 मधुमेह के नए चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान के लिए अनुमति देता है और T1D रोगियों में प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं प्रदान करने के लिए कर सकता है। इन विट्रो में hESCs से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को पैदा करने में सबसे सफल प्रयास भ्रूण घटनाओं है कि अग्नाशय विकास 4, 5 के दौरान हो पुनरावृत्ति करना है। यह अलग संकेत दे रास्ते के हेरफेर सही विकासशील अग्न्याशय के प्रमुख चरणों मॉडल करने के लिए शामिल है। अग्नाशय के विकास निश्चित एण्डोडर्म, जो CXCR4 और CD117 (सी-किट) 8, 9 की अभिव्यक्ति की विशेषता है की प्रेरण के साथ शुरू होता है। definit की सटीक विनियमनIve एण्डोडर्म संगठन पेट ट्यूब, जो है तो पूर्वकाल-पीछे करने के लिए और उदर-पृष्ठीय patterning से होकर गुजरती है के गठन के लिए आवश्यक है। पृष्ठीय और उदर अग्नाशय कलियों पीछे अग्रांत्र कि अग्नाशय और ग्रहणी homeobox जीन (Pdx1), जो अग्नाशय के विकास के लिए 10 आवश्यक है व्यक्त करता है के क्षेत्र से उभरेगा। पृष्ठीय और उदर कलियों फ्यूज अग्न्याशय, जो तब व्यापक उपकला remodeling और विस्तार 11 से होकर गुजरती है के रूप में। अंत: स्रावी और बहि वंश के प्रति प्रतिबद्धता multipotent पूर्वज कोशिकाओं (MPCs) कि व्यक्त की पीढ़ी के साथ है, दूसरों के बीच में, प्रतिलेखन कारक Pdx1, Nkx6.1 और Ptf1a 12, 13। MPCs कि अंत: स्रावी और नलीपरक कोशिकाओं हो जाएगा Nkx6-1 व्यक्त करने के लिए Ptf1a अभिव्यक्ति कम हो रही है, जबकि जारी है। इस के विपरीत, बहि वंश कोशिकाओं expressio खो देंगेNkx6-1 के एन और Ptf1a अभिव्यक्ति 12 बनाए रखें। प्रतिलेखन कारक Nkx6-1 विशेष रूप से अंत: स्रावी पूर्वज कोशिकाओं कोशिकाओं बीटा के भेदभाव के दौरान, अग्नाशय के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका है। पहले से अग्नाशय के विकास 14 के दौरान वर्णित है, β कोशिकाओं के गठन में बिगड़ा Nkx6-1 परिणामों का विलोपन के रूप में। इसलिए, दोनों इन विट्रो में और vivo में इंसुलिन के उत्पादन β कोशिकाओं को पैदा करने Nkx6-1 के कुशल प्रेरण की आवश्यकता है। हमने हाल ही में एक प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक hPSCs से Pdx1 + / NKX6-1 + अग्नाशय पूर्वज उत्पन्न करने के लिए विकसित की है। ये hPSC व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वज immunodeficient चूहों 3 में प्रत्यारोपण पर परिपक्व β कोशिकाओं को उत्पन्न। 1) निश्चित एण्डोडर्म प्रेरण: भेदभाव प्रोटोकॉल 4 में विभाजित किया जा सकता है की विशेषता चरणों2) पीछे अग्रांत्र patterning, 3) अग्नाशय विनिर्देश और 4) NKX6-1 प्रेरण। यहाँ हम निर्देशित भेदभाव के हर कदम का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and cytokines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol (MTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC/CF&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash buffer, 1x</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR990210</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80510-412&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>88150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NO636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOGGIN</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3344-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SANT-1</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for flow cytometry (working dilutions)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 PE (1:100)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>CD11705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC (1:50)</td>
			<td>BD&#160; Bioscience</td>
			<td>551966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td>
			<td>705-546-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype Control Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&#160;</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype Control Goat IgG</td>
			<td>R&#38;D&#160;&#160;</td>
			<td>AB-108-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX6-1 (1:2000)</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDX1 (1:100)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient differentiation of pluripotent stem cells to nkx6-1+ pancreatic progenitors

स्टेम कोशिकाओं की क्षमता आत्म करने के लिए नवीनीकृत और कई प्रजातियों के लिए अंतर है, उन्हें इस बात का अध्ययन और मधुमेह के भविष्य के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक आकर्षक स्रोत बना रही है। यह लेख एक चार चरण भेदभाव मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल की रूपरेखा। इस प्रोटोकॉल मानव स्टेम सेल (hPSC) लाइनों की संख्या के लिए लागू किया जा सकता है। दृष्टिकोण अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लिया hESCs सही अग्नाशय विकास के प्रमुख चरणों मॉडल करने के लिए अंतर करने के लिए है। यह निश्चित एण्डोडर्म, जो Activin ए, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) और CHIR990210 की उपस्थिति में संवर्धन कोशिकाओं द्वारा हासिल की है की प्रेरण के साथ शुरू होता है। आगे भेदभाव और fibroblast वृद्धि कारक 10 (FGF10) और Dorsomorphin साथ patterning पीछे अग्रांत्र जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। Retin के अलावाओआईसी एसिड, नोगिन, संत-1 और FGF10 अग्नाशय एण्डोडर्म की विशेषता कोशिकाओं में पीछे अग्रांत्र कोशिकाओं differentiates। अंत में, epidermal वृद्धि कारक (EGF) के संयोजन, Nicotinamide और नोगिन Pdx1 + / NKX6-1 + कोशिकाओं के कुशल पीढ़ी की ओर जाता है। प्रवाह cytometry अग्नाशय के विकास की कुंजी चरणों में विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। Pdx1 + / NKX6-1 + अग्नाशय स्टेज 4 के अंत में progenitors immunodeficient चूहों में प्रत्यारोपण पर परिपक्व β कोशिकाओं को पैदा करने में सक्षम हैं और आगे इन विट्रो में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए भेदभाव किया जा सकता है। इस प्रकार, Pdx1 के कुशल पीढ़ी + / NKX6-1 + अग्नाशय पूर्वज, के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया है, क्योंकि यह इन विट्रो में मानव अग्नाशय के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है बहुत महत्व का है और करने के फर्क की क्षमता के साथ कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करता है β कोशिकाओं कि eV कर सकता हैentually मधुमेह के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

के रूप में चित्रा 1 ए में योजनाबद्ध में सचित्र अग्नाशय progenitors के कुशल उत्पादन, उचित वृद्धि और भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान विशिष्ट संकेतन अणुओं की सटीक अलावा द्वारा पीछा undifferentiated कोश?...

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Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

यहाँ हम NKX6-1 + विट्रो में अग्नाशय के पूर्वज करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक 4 चरण प्रोटोकॉल का वर्णन। इस प्रोटोकॉल मानव स्टेम सेल लाइनों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।

Pluripotent के कुशल भेदभाव स्टेम कोशिकाओं को NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; अग्नाशय प्रोजेनिटर्स

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

The overall goal of this procedure is to efficiently generate NKX6.1 expressing pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells in vitro by differentiating the cells through four key stages of pancreatic development. By differentiating human pluripotent stem cells through four key stages of pancreatic devleopment, this protocol provides a model to study human pancreas development in vitro. The main advantage of this technique over existing protocols is that we are able to generate high percentages of NKX6.1 positive pancreatic progenitor cells using a variety of human pluripotent stem cell lines.Given that pancreatic progenitors have the potential to generate insulin producing beta like cells, this technique will give us the opportunity to develop cells for diabetes treatment, for drug discovery and for disease modeling. On day zero, begin differentiation by replacing the KnockOut serum replacement media with day zero differentiation media. Then one days one and two, gently shake the plate to remove any dead cells from the monolayer before aspirating the media.Afterward, replace it with day one to two differentiation media. On day three, harvest the cells for flow cytometry. If the cells express more than 90%of CXCR4 and CD117, the efficiency has been reached.Then gently shake the plate to remove any dead cells from the monolayer prior to aspiration and replace it with day three to five differentiation media. It is important to ensure efficient induction of the definitive under derm by day three by flow cytometry. If the percentage of cells expressing both CXCR4 and CD117 is lower than 90%differentiation to pancreatic progenitors will likely be compromised.On days six and seven, replace the medium with day six to seven differentiation media. On days eight, 10 and 12, replace the medium with day eight to 12 differentiation media. Then on day 13, harvest the cells for flow cytometry to determine PDX1 and NKX6.1 expression.To harvest the cells for flow cytometry analysis, disassociate the cells with commercial Trypsin solution according to the manufacturer's protocol and incubate the cells at 37 degrees Celsius for three minutes. After three minutes, remove the Trypsin solution and re-suspend the single cells in 1, 000 microliters of fax buffer with 30 microliters of DNA One. Then filter the cells using a 35 micrometer nylon mesh cell strainer and transfer them to a micro centrifuge tube.Centrifuge the cells at 455 times g for five minutes before preparing the cells for live or fixed staining. Now re-suspend the cells in 1, 000 microliters of fax buffer. Transfer 200 microliters into two wells of a 96 well plate for both unstained and stained samples.Afterward, centrifuge the plate at 931 times g for two minutes, afterward remove the supernatant by inverting the plate, stain the cells with primary conjugated antibody in a final volume of 100 microliters for 30 minutes at room temperature and protect them from light. Subsequently, centrifuge the plate at 931 times g for two minutes, after two minutes remove the supernatant by inverting the plate. Following that, re-suspend the samples in 100 microliters of fax buffer.Then centrifuge the plate 931 times g for two minutes. And remove the supernatant by inverting the plate. Next re-suspend the samples in 300 to 500 microliters of fax buffer, transfer them to the one milliliter micro test tubes or the five milliliter round bottom tubes and run the samples on flow cytometor.If the samples cannot be run immediately, store them at four degrees Celsius and protect it from light. In this procedure, re-suspend the cell pellet in commercial fixation and permeable Isation solution for 24 hours at four degrees Celsius. After 24 hours, centrifuge the sample at 455 times g for five minutes, then re-suspend it in 400 microliters of commercial perm wash solution.Next, transfer 200 microliters of the sample in two wells of a 96 well plate for IGG control and PDX1, NKX6.1 staining, centrifuge the plate at 931 times g for two minutes. Then re-suspend the cell pellets in 100 microliters of commercial perm wash solution containing anti-PDX1 and anti-NKX61 primary or isotope control antibodies. Incubate them overnight at four degrees Celsius.The next day, centrifuge the plate at 931 times g for two minutes, remove the supernatant by inverting the plate and re-suspend the samples in 100 microliters of the commercial perm wash solution. Next, centrifuge the plate at 931 times g for two minutes. Remove the supernatant by inverting the plate.Then re-suspend the samples in 100 microliters of perm wash solution containing secondary antibody at room temperature for one hour and protect it from light. After an house, centrifuge the plate 931 times g for two minutes, then remove the supernatant by inverting the plate, following that, re-suspend the samples in 100 microliters of commercial perm wash solution, centrifuge the plate at 931 times g for two minutes, remove the supernatant by inverting the plate. Then, re-suspend the sample in 100 microliters of commercial perm wash solution and centrifuge the plate at 931 times g for two minutes again before removing the supernatant.Next, re-suspend the samples in 300 to 500 microliters of fax buffer and transfer them into the separate one milliliter test tubes or five milliliter round bottom tubes for running flow cytometry. Shown here is a sematic of the induction of pancreatic progenitor from human embryonic stem cells which indicates day of differentiation, develop mental stage, base media and the cytokines added at every stage. And here are the phase contrast images at the key stages of pancreatic differentiation.H1 cells were differentiated according to the four stage differentiation protocol depicted. With undifferentiated human embryonic stem cells at day zero, definitive endo derm at stage one, posterior four gut at stage two, pancreatic endo derm at stage three and NKX6.1 positive endo derm pancreatic progenitors at stage four. This figure shows the day three representative flow cytometry plots for CXCR4 PE and CD117 APC antibody staining.Here is the unstained sample and here is the stained sample. And this figure shows day 13 representative flow cytometry plots for stage four derived pancreatic progenitor cells expressing NKX61 and PDX1. This is the IGG control and this is the stained sample.Once mastered, this technique can be done in 13 days. However this may vary depending on the cell line used. While attempting this procedure, it is important to test all agents due to batch to batch variability.After following the procedure, the NKX6.1 positive pancreatic progenitor cells can be further differentiated to insulin producing beta like cells using other published protocols. This provides a platform for studying beta cell maturation and development in vitro. After watching this video, you should have a good understanding of how to efficiently differentiate human pluripotent stem cells to pancreatic progenitors by taking the cells through four key stages of development.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

मानव pluripotent की इन विट्रो भेदभाव में स्टेम कोशिकाओं Trophoblastic में कोशिकाओं

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से नैदानिक संगत Corneal अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं के कुशल और स्केलेबल निर्देशित भेदभाव

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए DMSO के साथ मानव Pluripotent स्टेम सेल के क्षणिक उपचार

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

पराबैंगनी-सी (यूवी-सी) क्षति के जवाब में प्राथमिक माउस नेत्र सतह कोशिकाओं/स्टेम सेल में ऑक्सीडेटिव क्षति का आकलन

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

मानव भ्रूण स्टेम सेल के एकल सेल संस्कृति का उपयोग कर कुशल तंत्रिका भेदभाव

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों के तहत मानव Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करपोस्टाग्लियन सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुशल भेदभाव

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...