Name: induction of an inflammatory response in primary hepatocyte cultures from mice
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01HL128714 إلى CF) و (F31DK10236101 إلى KS)، وجمعية القلب الأمريكية (قوات التحالف وAG).

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية والإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من كلية الحقوق بجامعة ميامي ميلر للطب. 1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن وسائل الا...

<ol>
	<li>Silverstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+chronic+kidney+disease:+role+in+the+progression+of+renal+and+cardiovascular+disease.">Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease.</a> Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).</li><li>Isakova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+is+elevated+before+parathyroid+hormone+and+phosphate+in+chronic+kidney+disease.">Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).</li><li>Faul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF23+induces+left+ventricular+hypertrophy.">FGF23 induces left ventricular hypertrophy.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).</li><li>Guti&#233;rrez, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+and+mortality+among+patients+undergoing+hemodialysis.">Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis.</a> N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).</li><li>Munoz Mendoza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+and+Inflammation+in+CKD.">Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).</li><li>Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Guti&#233;rrez, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+Fibroblast+Growth+Factor-23+with+Markers+of+Inflammation,+Insulin+Resistance+and+Obesity+in+Adults.">Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+directly+targets+hepatocytes+to+promote+inflammation+in+chronic+kidney+disease.">Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. , 1-12 (2016).</li><li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver.">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li><li>Moshage, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+interleukin-1,+interleukin-6+and+its+interrelationship+on+the+synthesis+of+serum+amyloid+A+and+C-reactive+protein+in+primary+cultures+of+adult+human+hepatocytes.">The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes.</a> Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).</li><li>Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+liver+toxicity+testing.">In vitro models for liver toxicity testing.</a> Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).</li><li>Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Hepatocytes+by+a+Two-step+Collagenase+Perfusion+Procedure.">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+Isolation+of+Primary+Human+Hepatocytes+and+Corresponding+Major+Populations+of+Non-parenchymal+Liver+Cells.">Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Moshage, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+the+hepatic+acute+phase+response.">Cytokines and the hepatic acute phase response.</a> J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+pathway+in+the+liver:+From+physiopathology+to+therapy.">IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy.</a> J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).</li><li>Grabner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Cardiac+Fibroblast+Growth+Factor+Receptor+4+Causes+Left+Ventricular+Hypertrophy.">Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy.</a> Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).</li><li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17,+Long-Term+Culture+and+Coculture+of+Primary+Rat+and+Human+Hepatocytes.">Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes.</a> Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).</li></ol>

عزل خلايا الكبد الأولية من الفئران هو أداة سريعة وغير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الاستجابات الالتهابية خارج الحي. إذا أجريت بشكل صحيح، النتائج التي يمكن أن تتولد بسهولة ومستنسخة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة من حيث التكلفة. وينبغي تقييم النقاط التالية ...

مرض الكلى المزمن (CKD) يمكن تعريفها بأنها حالة من الالتهاب الحاد والمزمن 1. في المرضى الذين يعانون من كد، ومستويات المصل من هرمون الليفية عامل النمو phosphaturic 23 (FGF23) يرتفع تدريجيا من أجل الحفاظ على الفوسفات في الدم التوازن 2. وترتبط زيادة مستويات FGF23 المصل بشكل مستقل مع معدلات الاعتلال والوفيات القلب والأوعية الدموية لدى المرضى الذين بدأوا العلاج غسيل الكلى 3، 4. وعلاوة على ذلك، أظهرت العديد من الدراسات السريرية وجود علاقة قوية بين مستويات FGF23 مرتفعة ومستويات مصل البروتين سي التفاعلي (CRP)، انترلوكين 6 (IL-6) وورم α عامل نخر (TNFα) 5، 6. وعلاوة على ذلك، في دراسة تجريبية، قمنا في الآونة الأخيرة أظهرت أن FGF23 يمكن أن تستهدف مباشرة خلايا الكبد ويسبب استجابة التهابية من خلال زيادة البروتين وIL-6 صرودوكشن في الكبد 7. وبالتالي، FGF23 قد يكون بمثابة عامل المتداولة التي تساهم في التهاب النظامية في CKD. في 70 في وقت مبكر، وكانت خلايا الكبد الأولية معزولة ودرس لأول مرة 8. ومنذ ذلك الحين استخدمت خلايا الكبد مثقف الابتدائي على نطاق واسع لدراسة معالجة الأيض، وظيفة الهرمونية، استقلاب الدواء وسمية وكذلك الحصانة والاستجابات الالتهابية 9 و 10. ووصف البروتوكولات السابقة أساسا العزلة الأنزيمية من خلايا الكبد الأولية من أنسجة الكبد البشري 11 و 12. بينما نموذجا ممتازا، وهذا يترك من القدرة على دراسة كيفية التلاعب الجيني يؤثر على آليات إشارات الكبد معقدة وكذلك العواقب الوظيفية على أنواع مختلفة من المحفزات. في ما يلي، وصفنا عزل خلايا الكبد الأولية الفئران. والجدير بالذكر، يمكن تحليل تأثير عدة وسطاء للاستجابة في المرحلة الحادة الكبدية، مثل lipopolysaccharide في (LPS)، IL-6 و FGF23 في وسيلة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار بطريقة 13. هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنزيمية من خلايا الكبد من فئران بالغة، وعلينا أن نبرهن على المحرضات التي أنشئت من التهاب، مثل LPS وIL-6، وكذلك وسطاء التهابات جديدة مثل FGF23، يمكن أن تحفز مباشرة التعبير وإفراز السيتوكينات الالتهابية، مثل البروتين وIL-6 في خلايا الكبد مثقف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Consumables</td>
			<td style="width:283px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Strainer 70 &#956;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 6-inch Cotton Tipped Applicators&#160;</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>SP115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minipuls 3 Perfusion Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer Kits, Propper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer Cover Glasses, Propper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissers - Sharp/Blunt</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Iris Scissors-ToughCut Straight</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Dumont SS-45 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11203-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Student Tissue Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>991121-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid solution, 2.0 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; A8976-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>&#160;&#160; 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 50989-161-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine 100 mg/mL</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Willams&#39; Medium E (1x)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liver Perfusion Medium (1x)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>17701-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liver Digest Medium (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17703034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>CM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>CM4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-717</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of an inflammatory response in primary hepatocyte cultures from mice

الكبد يلعب دورا حاسما في تنظيم الالتهابات. في أمراض الكلى المزمنة على وجه الخصوص، حيث يتفاعل الكبد ردا على الوسط اليوريمي، الاكسدة، endotoxemia وإزالة انخفضت تعميم السيتوكينات proinflammatory من خلال إنتاج عدد كبير من المواد المتفاعلة في المرحلة الحادة. أدوات تجريبية لدراسة التهاب والدور الأساسي لخلايا الكبد هي أساسية لفهم التنظيم ومساهمة السيتوكينات الكبد إلى مرحلة الاستجابة الحادة النظامية وسيناريو لفترات طويلة الموالية للالتهابات، وخصوصا في بيئة معقدة مثل مرض الكلى المزمن. منذ دراسة آليات معقدة من التهاب في الجسم الحي لا تزال صعبة، والموارد كثيفة، وعادة ما يتطلب استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا، وتقدم خلايا الكبد معزولة الأولية أداة قوية لاكتساب رؤى الآلية في الاستجابة المرحلة الحادة الكبدية. لأن هذا في المختبر تقنية ملامح التكاليف المعتدلة، وإعادة عاليةالطاقة الانتاجية والمعرفة التقنية المشتركة، يمكن للخلايا الكبد معزولة الأولية أن تستخدم أيضا بسهولة كنهج الفرز. هنا، نحن تصف طريقة القائم على الأنزيمية لعزل خلايا الكبد الفئران الأولية، وصفنا تقييم استجابة التهابية في هذه الخلايا باستخدام ELISA والكمي في الوقت الحقيقي PCR.

<html> علم الانسجة وصفت الممثلة صور المجهر الضوئي من الخلايا المعزولة ومثقف الابتدائي في الشكل 1A. يوضح تحليل Immunocytochemical أن خلايا الكبد معزولة تعبر عن درجة عالية من الزلال (الحمراء)، وكذلك ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice at JoVE.com

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

هنا، وتبين لنا نهجا الأنزيمية لعزل خلايا الكبد الأولية من الفئران الكبار، ونحن تصف الكمي لاستجابة التهابية باستخدام ELISA وفي الوقت الحقيقي PCR.

تحريض استجابة التهابية في الثقافات الابتدائية الكبدية من الفئران

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

The overall goal of this procedure is to successfully isolate functional murine hepatocytes for studying the expression and secretion of inflammatory cytokines such as CRP and IL6 in response to mediators of the hepatic acute phase response. This method could help answer key questions of hepatocellular function and the contribution of hepatic cytokines to a prolonged inflammatory environment as found in chronic kidney disease. The main advantage of this technique is that it provides a robust tool for a simple, fast, and reproducible analysis of hepatic metabolomics and inflammation as well as a response to drugs.To begin, preheat the liver perfusion medium and liver digest medium in a water bath at 37 degrees Celsius. Set up a perfusion pump as shown here. Then use liver perfusion medium to carefully pre-fill the tubing system of the pump.Try avoiding any air bubbles in the system. Prepare the stereotactic microscope for the perfusion procedure. Then after anesthetizing a donor mouse according to the text protocol, place the anesthetized animal on an absorbent pad.Use adhesive tape to fix the mouse's extremities. Next, shave and disinfect the abdomen of the mouse. Then use surgical scissors with sharp blunt tips to perform a ventral laparotomy from the pubis to the cranial border of the liver.Incise the abdominal wall on both sides at a position caudal to the diaphragm. Expose the inferior vena cava or IVC by carefully moving the intestine to the right side using sterile cotton swabs. With fine surgical scissors and sharp sharp tips, make lateral incisions across the suprahepatic diaphragm and open the thoracic cavity.Then use 5-0 surgical silk to ligate the thoracic IVC. With a shielded IV catheter, cannulate the infrarenal IVC. Connect the perfusion pump and start perfusing the liver.If performed properly, the liver should immediately begin to blanch and swell. Next, with fine surgical scissors, transect the portal vein, allowing suitable drainage of blood and perfusion medium. After perfusing the liver with approximately 30 milliliters of liver perfusion medium, stop the perfusion pump.Switch to liver digest medium and resume the pump. Once perfusion is complete, remove the cannula. Gently expose the central region of the liver and locate the connecting tissue linking the liver lobes.Grab the central connecting fibers and carefully dissect all the tissues holding the liver in place. Then gently remove the liver. Immediately transfer the organ into a 50 milliliter polypropylene conical tube containing 15 milliliters of liver digest medium.While working under a cell culture hood, transfer the liver from the 50 milliliter polypropylene conical tube into a sterile tissue culture dish. With sterile forceps, gently tear the four lobes of the liver. If performed properly, the digestion medium should become turbid duet to the isolation of hepatocytes from the liver.Using a 25 milliliter sterile pipette tip, filter the turbid digestion medium through a 70 micrometer nylon cell strainer into a new 50 milliliter polypropylene conical tube to remove undigested tissue particles and cell debris. Centrifuge the combined filtrate at 50 times g in four degrees Celsius for two minutes, then aspirate the supernatant containing excess cell debris and use 25 milliliters of cold 1X William's Medium E to gently resuspend cells. After repeating the filtering and washing of the hepatocytes three times, aspirate the supernatant to remove excess cell debris.Resuspend the cells in 25 milliliters of warm 1X William's Medium E that contains primary hepatocyte thawing and plating supplements and filter the suspension through a new 70 micrometer nylon cell strainer into a 50 milliliter conical tube. Once the cells have been counted, plate them in two milliliters of William's Medium E that contains primary hepatocyte thawing and plating supplements on a collagen-coated six well cell culture cluster. Following two changes of medium to eventually starve the cells, treat the cells with PBS as vehicle, 25 nanograms per milliliter of FGF23, 100 micrograms per milliliter of LPS, or 50 nanograms per milliliter of IL6 in serum-free medium.Incubate the cultures for 24 hours. After preparing RNA using a spin column kit according to the manufacturer's instructions, add 200 nanograms of the isolated RNA to a PCR tube. Then add 14 microliters of endonuclease-free water and four microliters of reverse transcriptase to the tube.Place the PCR tube into the thermocycler and run the following reverse transcription program to generate cDNA. To carry out quantitative PCR, combine the following QPCR master mix components in a tube on ice. Vortex the master mix.Then aliquot nine microliters of the solution into each well of a 96 well plate. Carefully add one microliter of cDNA into each well, preparing three wells for each sample. Finally, run the samples in a real-time PCR instrument and analyze the data according to the text protocol.A representative light microscopy image of primary isolated and cultured cells are depicted here. Immunocytochemical analysis demonstrates that isolated hepatocytes highly express albumin as well as fibroblast growth factor receptor 4. In this experiment, primary isolated hepatocytes were treated with FGF23, LPS, or IL6 for 24 hours and mRNA levels of CRP and IL6 were analyzed by quantitative real-time PCR.LPS, IL6, and FGF23 significantly increased expression of CRP and IL6. As shown here, cell culture supernatants from isolated primary hepatocytes were analyzed by ELISA for CRP levels. As demonstrated with QPCR analysis, LPS, IL6, and FGF23 treatments significantly increased CRP levels in cell supernatants when compared to PBS-treated cells.Once mastered, this technique can be done in just a few hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to maintain a sterile environment. Due to working with primary culture, minimizing the risk of possible contamination is most important for achieving optimal results.After watching this video, you should have a good understanding of how to successfully isolate murine hepatocytes for studying various hepatocellular functions such as expression and secretion of hepatic cytokines.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

تحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبية في الفئران SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

التعريفي للشلل وإصابة النظام المرئي في الفئران التي تي الخلايا المحددة للبصري المياليني أقوابورين أوتوانتيجين-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

آثار الذوق مما يشير إلى إلغاء البروتين على التهاب الأمعاء في طراز ماوس مرض التهاب الأمعاء

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...