Name: a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

نشكر البروفيسور جيفري واستينيس، جامعة كولومبيا البريطانية، للتعبير عن البذور رفب-TUB6 ومراجع مجهول للحصول على تصحيحات مفيدة. ونحن ممتنون للبروفيسور هيو ديكنسون لتنبيهنا إلى استخدام فيلم السليلوز كدعم ميكانيكي وجون بيكر للتصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل بمنح البحوث ببسك / بب / G013993 / 1 و بب / D004055 / 1 إلى إم، وجائزة تدريب الدكتوراه ببسرك ومنحة كلارندون إلى سك

1 - إنشاء الغرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قطع الزجاج، وقطع 3 مم شرائح واسعة من نهاية شريحة المجهر 1 ملم. باستخدام سيانوكريلات فائقة الغراء أو الشريط على الوجهين، والغراء هذه الشرائط الزجاج ما يقرب من 45 ملم وبصرف النظر عبر عرض شريحة المجهر الثاني ( الشكل 1A ). مطلوب شريحة واحدة في الغرفة، بالإضافة إلى الشرائح الإضافية لصب ألواح أجار (شريحة واحدة سوف تسفر 2-3 ألواح أجار). يمكن إعادة استخدام الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين شرائط الزجاج، والأزياء طوقا من ارتفاع متطابقة من بولي إيثيلزيلوكسان بولي (غاما). وضع الكرة من بولي (ديميثيلزيلوكسان) الصمغ على الشريحة ( الشكل 1B )، الرطب شريحة ثانية مع كمية صغيرة من 100٪ من الايثانول المطلق، وتسطيح بولي (ديميثيلزيلوكسان) الكرة اللثة مع الشريحة الثانية حتى وصلت إلى الارتفاع من شرائط الزجاج ( الشكل 1C ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، وتقليم الزائدة بولي (الدايمثيلزيلوكسان) الصمغ مع شفرة حلاقة وتكرار تسطيح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام القاطع مناسبة أو شفرة حلاقة المبللة في الايثانول المطلق، وإزالة الجزء الداخلي من الصمغ بولي (ديميثيلزيلوكسان) لخلق تجويف التي سوف تعقد في وقت لاحق الشتلات وبلاطة أجار ( الشكل 1D ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم بعناية هلام مع شفرة حلاقة لخلق طوقا مع سمك الجدار النهائي ما يقرب من 2 مم ( الشكل 1E ). نفاذية الغازات من خلال حاجز بولي (ديميثيلزيلاكسان) مستقلة عن سمك فوق 50 ميكرون 11 . </li></ol> 2. إنشاء أجار-- صلابة بلاطة النمو المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شريحة المجهر مع اثنين من شرائط الزجاج، ووضع ساترة (22 مم × 50 مم) بحيث تقع على كل من شرائط الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ذابت نصف القوة موراشيج وسكوغ متوسطة النمو تحتوي على 1٪ ث / س السكروز و 1.5٪ ث / الخامس أغار (½ مس) في الفضاء الناتجتحت ساترة حتى يتم شغل هذا الأخير تماما (حوالي 1 مل الحجم الكلي) وترك حتى يتم تعيين أجار (حوالي 5 دقائق). ملاحظة: المركبات الدوائية يمكن أن تدار من خلال لوح أجار بإضافة تركيزات مناسبة إلى وسط السائل قبل سكب بلاطة. وقد تم اختبار هذا بنجاح ل ديكساميثازون 12 ، إيزوكسابين، 2،6-ديكلوروبنزونيتريل (دسب)، أوريزالين، و لاترونكولين B. </li></ol> 3 - الانتهاء من إعداد غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء بتوازن بد عن طريق هز حجم صغير من بد في أنبوب 7 . إضافة كمية صغيرة (حوالي 200 ميكرولتر) من الهواء معاير بد إلى البئر من طوقا هلام، ولكن لا ملء الغرفة تماما. وهذا بد يساعد على تجنب محاصرة فقاعات الهواء تحت لوح أجار كما يتم وضعها في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة من لوح أجار (في الخطوة 2.2 أعلاه) واستخدام شفرة حلاقة لقطع جزء من ديسيريد الحجم والشكل. ثم ضعه في بئر من طوقا هلام ( الشكل 1F ). يجب أن يكون هناك فجوة من 2-4 ملم إلى طوقا في جميع أنحاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة تماما مع الهواء معاير بد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع واحد أو أكثر من الشتلات A. ثاليانا (ما يصل إلى 3 شتلات للتصوير أكثر من 2-3 أيام) على لوح أجار مع كوتيليدونس وهيبوكوتيل معلقة على الحافة، وتطفو في بد ( الشكل 1G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على الشتلات، تعقيم البذور مع 70٪ من الإيثانول، النبات على ½ مس المتوسطة تستكمل مع 1٪ السكروز و 0.8٪ أجار، ستراتيفي لمدة 2-4 أيام في 4 درجات مئوية، وتنمو على لوحات موجهة عموديا عند 22 درجة مئوية في 16 ساعة ضوء / 8 ساعة نظام الظلام. للجذور الجانبية التصوير، وتنمو النباتات لمدة 7-10 أيام قبل نقلها إلى غرف التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإغلاق الغرفة، وتطبيق ساترة مطابقة لبصريات الهدف، والضغط عليه بلطف أسفل حافة شريحة المجهر الزجاجي حتى ساترةويستند على كل من شرائط الزجاج ( الشكل 1H ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين ساترة مع شرائط من 1.25 سم واسعة ميكروبور الشريط الجراحية قطع في نصف طول الحكمة على كل نهاية إذا رغبت في ذلك ( الشكل 1I ). السماح للعينة لتسوية لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل التصوير. هذا يقلل من حركة العينة أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التصوير مع المجهر تستقيم للحفاظ على الركيزة تسيطر على النمو. استخدام أهداف 20X / 0.7NA أو 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

<ol>
	<li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22 (2015).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+water.">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium.">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update:+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology,+physiology,+development+and+cell+biology.">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140 (2014).</li><li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+in+liquid+perfluorocarbons.">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues.">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+thickness+dependence+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+membranes.">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li><li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis.">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li><li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set.">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li><li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis.">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430 (2011).</li><li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis.">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li><li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li><li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel.">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الطريقة المعروضة هنا هي استراتيجية بسيطة للتصوير مبائر عالية الدقة لتطوير الجذور الجانبية لمدة سنتين وتصل إلى ثلاثة أيام. لفترات تصل إلى 48 ساعة، لم يلاحظ أي آثار ضارة لنظام التصوير على تطوير الجذر الجانبي. بعد 48 ساعة، بدأ متوسط ​​نمو الجذر الجانبي في التباطؤ، على الرغم من أن مجموعة فرعية كبيرة من الجذور (37٪) استمرت في النمو بمعدلات مماثلة لمتوسط ​​نمو الجذور على الصفائح. لذلك، من خلال تصوير عدد كبير بما فيه الكفاية من الجذور، الجذور التي تباطأ النمو بعد 48 ساعة يمكن استبعادها. لم يتم إجراء اختبارات منتظمة لغرف التصوير لفترات أطول من 72 ساعة، ولكن ينصح باستراتيجيات بديلة إذا كانت فترات التصوير الموسعة مطلوبة. يمكن ترك غرف التصوير على المسرح المجهر بشكل مستمر، إذا تم توفير الظروف البيئية المناسبة، أو إزالتها إلى منشأة النمو وعاد بشكل دوري إلى المجهر. هذا يسمح العديد من غرف ليتم تصويرها في موازاة. &lt;/ P&gt; ميزة واحدة من غرف وصفها هنا هو أن الجذور الجانبية ثابتة في موقفها ويمكن تصويرها باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. الاستقرار المكاني يعتمد بشكل حاسم على تركيز أجار المستخدمة في بلاطة أجار دعم. في البداية تم اختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من أجار 0.8٪ إلى 2٪ آجار، وكشف عن أن تركيزات عالية في هذا النطاق جذور ثابتة ثابتة في الفضاء، ولكن تباطؤ نمو الجذر بشكل أسرع وبعض الجذور عرضت علامات الإجهاد الميكانيكي، بما في ذلك انخفاض استطالة الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تركيزات أجار منخفضة لم توفر الدعم المطلوب وجذور انجرفت في x، y، z خلال التصوير. المثلى 1.5٪ أجار بلاطة يثبت موقف العينة دون آثار ميكانيكية ضارة. في ظل هذه الظروف، بعد تسوية في أول 30 دقيقة أو نحو ذلك، جذور مستقرة على مدى ساعات عديدة، مما يسمح الحصول على البيانات بين عشية وضحاها. أثناء الحصول على البيانات 4D، كانت نطاقات z- كومة عادة بمضرب من 5-10 ميكرون إضافية ولكن هذا كان أساسا لاستيعاب النمو خارج الطائرة من الجذور الجانبية بدلا من z-- الانجراف أو تمايل. على الرغم من أن تركيز أجار القياسية يوفر بعض المقاومة ضد الاختراق، والجذور المتنامية غرافيتروبيكالي في نهاية المطاف تخترق أجار. ومع ذلك، من خلال تعديل طفيف من غرفة التصوير، ويمكن الحفاظ على نمو الجذر موازية ساترة، مما يسمح للجذور الجانبية القديمة والجذور الأولية لتكون تصوير. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكون مخصصة غرفة التصوير الأساسية ل هيبوكوتيلز. هيبوكوتيلز هي أكثر بحرية العائمة في هذا النظام بحيث تم زيادة قوس Z- محور للحصول على صورة عادة إلى حوالي 20 ميكرون. في هذه الدراسة، تم استخدام المجهر تستقيم في جميع أنحاء، مما يسمح للخصائص الركيزة ليتم السيطرة عليها. غرفة التصوير قد تكون قابلة للتكيف مع تكوينات المجهر مقلوب ولكن التأثير على الوقت من ساترة جامدة على اعتراض الأجهزة تحتاج إلى تقييم. </p&gt; وقد أشار ليتلجوهن وزملاؤه إلى أن بد نفسها لا تذوب بسهولة الجزيئات البيولوجية، مما يعني أنه لا يمكن استخدامها مباشرة لتسليم المركبات الدوائية 7 . تم التغلب على هذه المشكلة عن طريق توريد مثل هذه المركبات من خلال بلاطة من وسط النمو المعزز الذي يقع على لوح أجار. في حين أن نظم نضح ستبقى الطريقة المفضلة للتجارب غسل التدريجي، وقد استخدمت غرفة التصوير بنجاح لإدارة ديكساميثازون 12 والمركبات الأخرى. ملاحظة واحدة، في حين أن هذه المادة في التحضير فون واجنهيم وزملاؤه 18 وصفت غرفة للتصوير تطوير الجذر الجانبي باستخدام ورقة الضوء المجهري.

لدراسة العمليات الخلوية والخلايا التي تكمن وراء تطوير النباتات، وهناك طلب متزايد على استراتيجيات التصوير عالية الدقة على المدى الطويل عالية الدقة. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في تجارب التصوير هذه في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التبادل الغازي الكافي بالإضافة إلى إمدادات المياه والمغذيات 1 و 2 و 3 . لاستخدام الأهداف مع فتحات العددية العالية للقرار البصري الأمثل، وينبغي وضع العينات في مكان قريب وموجهة بالتوازي مع ساترة. الحركة في x، y، و z الاتجاهات يجب أن يكون الحد الأدنى خلال التصوير. في حين أن الشتلات غالبا ما يتم تركيبها في الماء أو محلول مائي للتصوير على المدى القصير، والماء لديه قدرة منخفضة لإذابة كو 2 و O 2 (1.54 ملغ / مل و 0.04 ملغ / مل، على التوالي عند 20 درجة مئوية، 0.1 ميجا باسكال) 4 ، مما يجعلفإنه غير مناسب لتجارب تمديد الوقت الفاصل. نظم الإرواء التي تحافظ على مستويات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية هي حل واحد لهذه المشكلة، وقد وضعت لكلا متحد البؤر المسح الضوئي بالليزر المجهري (كلسم) 1 ، 2 ، 3 والضوء ورقة المجهري (لسم) 5 . وقد صممت نظم مثل روتشيب 2 و روتاراي 3 خصيصا للتصوير الفاصل الزمني من الجذور النامية وتنطوي على بذور الإنبات في جهاز متعدد العينات بناء مخصص. هذه الترتيبات ضمان الحد الأدنى من الاضطرابات الميكانيكية ومصممة لتحليل مواز للشتلات متعددة، ولكن ليست الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية. وقد صممت كالدر وزملاؤه غرفة التصوير على أساس نضح أكثر تعقيدا الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية التي يقام العينة في موقف من قبل شبكةللسماح باستخدام العدسات التكبير الغمر عالية 1 . عرض هنا هو بديل، حل بسيط لهذه المشكلة التي لا تقوم على نظم نضح، ولكن يستخدم بيرفلوروديكالين (بد)، وهو بيرفلوروكربون التي اكتسبت شعبية مؤخرا كوسيلة متزايدة ل أرابيدوبسيس التصوير 6 ، 7 ، 8 . في هذه التطبيقات، والقدرة العالية لل بد لذوبان كو 2 و O 2 (1.9 غ / مل ل O 2 في بد مقارنة 0.04 ملغ / مل في الماء) 9 ، ويسمح التبادل الغازي من قبل الأنسجة مغمورة. وعلاوة على ذلك، بد هو غير الفلورسنت ومؤشر الانكسار (1.313) هو مقارنة مع الماء (1.333) وأقرب إلى أن من السيتوسول (~ 1.4) من الهواء (1.000) 6 . وقد تم الإبلاغ عن المركبات البيرفلوروكربونية لديها الحد الأدنى من التأثير الفسيولوجي على مجموعة متنوعة من النباتات والنباتات رالقضايا 6 ، مع بذور الفجل تنبت بسهولة عندما تغمر في بد ويظهر النمو الطبيعي والتنمية لمدة يومين على الأقل كامل أيام عند تزويده بالماء 10 . وقد أجريت ملاحظات مماثلة لإنبات بذور الأرابيدوبسيس 6 . استنادا إلى تحفيز رامان نثر مباشرة صورة توزيع بد في الأنسجة ورقة أرابيدوبسيس بعد تسلل، ويخلص ليتلجون وزملاؤه أن بد من المرجح لا تؤخذ من قبل الخلايا الحية 8 . وقد استخدم بد في الغالب إلى الأنسجة الجوية صورة، حيث أنه يزيد بشكل كبير عمق التصوير لأنها تتسرب بسهولة الفضاء الجوي بسبب التوتر السطحي المنخفض 6 . هنا، يتم اعتماد بد للتصوير مبائر على المدى الطويل من تطوير الجذور الجانبية. في هذا التكوين، يتم وضع شتلة واحدة أو أكثر على لوح من وسط النمو تتعزز مع أجار ومغمورة في بد. و بد يسمح gتبادل عاصي في غرفة التصوير، ومنع نقص الأكسجين. بد هو متقلب للغاية لذلك يتم الاحتفاظ بها من قبل طوقا من الصمغ بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) التي لديها أيضا عالية نفاذية الغاز (1.5 × 10 -12 بمول م -1 ق -1 با -1 ل كو 2 ) 11 . المغذيات والمياه يتم توفيرها من قبل بلاطة متوسطة صلابة مع أجار. في نفس الوقت، هذا أجار بلاطة يضغط بلطف الجذر ضد ساترة، وبالتالي تحديد موقفها النسبي في غرفة التصوير والسماح باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. وعلاوة على ذلك، لوح أجار يمكن استخدامها لإدارة مجموعة من العلاجات الدوائية، بما في ذلك ديكساميثازون، أوريزالين، وإيزوكسابين. يمكن تجميع غرف التصوير بأعداد كبيرة من الشرائح المجهرية القياسية باستخدام الحد الأدنى من المعدات. وقد وضعت غرف التصوير واتسمت لدراسة التنمية الجذر الجانبي ولكن قابلة للتكيف لتصوير أجهزة الشتلات الأخرى مثل نصائح الجذر الأولية وhypocotyls.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Perfluorodecalin</td>
			<td style="width:191px;">F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td>
			<td style="width:119px;">FLUTEC PP6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Poly(dimethylsiloxane) gum&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td>
			<td style="width:119px;">Item # 132700</td>
			<td style="width:167px;">Carolina Observation Gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cavity Microscope Slides</td>
			<td>VWR International Ltd, Lutterworth,&#160;UK</td>
			<td style="width:119px;">10118-600</td>
			<td>Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td style="width:119px;">604753</td>
			<td>Any &#39;super-glue&#39; suitable for glass will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cellulosic cellophane membrane</td>
			<td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td>
			<td colspan="2">325P cellulose film; 80mm disc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

العديد من جوانب التنمية النباتية، مثل التشكل الجانبي الجذر، تحدث على فترات زمنية من عدة أيام. لدراسة العمليات الخلوية والخلايا الكامنة وراءها، مطلوب استراتيجيات عالية الدقة الفاصل الزمني الفاصل الزمني التي تحافظ على الظروف الفسيولوجية. يجب أن يكون للأنسجة النباتية ما يكفي من المغذيات وإمدادات المياه مع تبادل الغاز المستمر، ولكن عندما غمرت وتجمد تحت ساترة، فهي عرضة بشكل خاص لنقص الأكسجين. إحدى الاستراتيجيات التي تم توظيفها بنجاح هي استخدام نظام نضح للحفاظ على إمدادات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية. غير أن هذه الترتيبات يمكن أن تكون معقدة ومرهقة وتتطلب معدات متخصصة. يعرض هنا هو استراتيجية بديلة لنظام التصوير بسيط باستخدام بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر. هذا النظام من السهل اقامة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، ويتم تركيبها بسهولة على مرحلة المجهر، والسماح لعدة غرف التصوير ليتم إعدادها وتصويرها في قدم المساواةعلال. في هذا النظام، لا يمكن تمييز معدلات نمو الجذر الجانبي عن معدلات النمو في ظل الظروف القياسية على لوحات أجار لليومين الأولين، ويستمر نمو الجذر الجانبي بمعدلات منخفضة ليوم آخر على الأقل. يتم توفير الأنسجة النباتية مع المواد الغذائية عن طريق لوح أجار التي يمكن استخدامها أيضا لإدارة مجموعة من المركبات الدوائية. تم إنشاء نظام لرصد التنمية الجذر الجانبي ولكن قابل للتكيف بسهولة إلى صورة الأعضاء النباتية الأخرى مثل هيبوكوتيلز والجذور الأولية.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

المقدمة هنا هو تقنية بسيطة عالية الدقة متحد البؤر الفاصل الزمني التصوير من الجذر وتطوير هيبوكوتيل لمدة تصل إلى 3 أيام باستخدام عالية الأهداف العددي الفتحة و بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر.

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

والمغمورة ساندويتش ورقة مرشح للالمدى الطويل<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; الوقت الفاصل بين التصوير من وقت مبكر الفرخ الأجنة

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

الآثار السلوكية والإنجابية الطويلة الأجل الجنينية التعرض لجرعة منخفضة سميات

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

[كنفوكل] تصوير مباشر من تبادل لإطلاق النار قمية الخلايا الإنشائية من الأنواع النباتية المختلفة

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...