Name: a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

Мы благодарим профессора Джеффри Вастенайса, Университет Британской Колумбии, за семена, выражающего RFP-TUB6, и анонимного рецензента за полезные исправления. Мы благодарны профессору Хью Дикинсону за то, что он предупредил нас об использовании целлюлозной пленки в качестве механической опоры и Джона Бейкера для фотографии. Эта работа была поддержана исследовательскими грантами BBSRC BB / G013993 / 1 и BB / D004055 / 1 для IM, и Докторантурой обучения BBSRC и Стипендией Кларендона в CK

1. Создание камеры <ol><li> Используя стеклянный резак, разрежьте полоски шириной 3 мм с конца предметного стекла микроскопа толщиной 1 мм. Используя клей-кaнaкрилатный клей или двустороннюю клейкую ленту, склейте эти стеклянные полоски приблизительно на 45 мм друг от друга по ширине второго слайда микроскопа ( рис. 1A ). Требуется один слайд на камеру, плюс дополнительные слайды для заливки агаровых плит (один слайд даст 2-3 агаровые плиты). Слайды можно использовать повторно. </li><li> Между стеклянными полосками создайте прокладку одинаковой высоты из газопроницаемой поли (диметилсилоксановой) смолы. Поместите шар из поли (диметилсилоксановой) смолы на предметное стекло ( рис. 1В ), намочите второй слайд с небольшим количеством 100% абсолютного этанола и сплющите шарик жевательной резинки поли (диметилсилоксана) вторым слайдом, пока он не достигнет высоты Стеклянных полосок ( рис. 1С ). <ol><li> Если необходимо, обрежьте лишний поли (десять центов)Тизилсилоксан) с помощью лезвия бритвы и повторного сплющивания. </li></ol></li><li> Используя подходящий резак или лезвие бритвы, смоченные в абсолютном этаноле, удалите внутреннюю часть полидиметилсилоксановой смолы, чтобы создать полость, которая позже удерживает рассаду и агарную плиту ( рис. 1D ). </li><li> Тщательно обрезайте гель лезвием бритвы, чтобы создать прокладку с конечной толщиной стенки около 2 мм ( рис. 1E ). Проницаемость газов через поли (диметилсилаксан) барьер не зависит от толщины выше 50 мкм 11 . </li></ol> 2. Создание затвердевшей агаром плиты среды роста <ol><li> На слайде с микроскопом с двумя стеклянными полосками поместите покровное (22 мм х 50 мм) так, чтобы оно лежало на обеих стеклянных полосках. </li><li> Пипетка расплавила половину проростка Мурашиге и Скуга, содержащую 1% мас. / Об. Сахарозы и 1,5% мас. / Об. Агар (½ МС) в полученное пространствоНиже покровного, пока последний полностью не заполнится (примерно 1 мл общего объема) и оставить до тех пор, пока агар не будет установлен (приблизительно 5 мин). Примечание: Фармакологические соединения могут вводиться через агарную плиту путем добавления соответствующих концентраций к жидкой среде перед тем, как сляб наливается. Это было успешно проверено на дексаметазон 12 , изоксабен, 2,6-дихлорбензонитрил (DCB), оризалин и латрункулин B. </li></ol> 3 . Завершение настройки камеры <ol><li> Воздух уравновешивает ПФО путем встряхивания небольшого объема ПФД в трубке 7 . Добавьте небольшое количество (приблизительно 200 мкл) ПФД, уравновешенного воздухом, в лунку гелевой прокладки, но не заполняйте камеру полностью. Это PFD поможет избежать захвата пузырьков воздуха под агаровой плитой, когда она помещается в камеру. </li><li> Снимите покровное стекло с агаровой плиты (на этапе 2.2 выше) и используйте лезвие для обрезания частиРазмера и формы. Затем поместите его в лунку гелевой прокладки ( рис. 1F ). Вокруг уплотнительной прокладки должен быть зазор 2-4 мм. </li><li> Полностью заполните камеру ПФД, уравновешенным воздухом. </li><li> Поместите одну или несколько саженцев A. thaliana (до 3-х сеянцев для визуализации в течение 2-3 дней) на агарную пластинку с семядолями и гипокотилем, висящим над краем, плавающим в ПФО ( рис. 1G ). </li><li> Для получения рассады стерилизуют семена 70% -ным этанолом, растят на среде ½ MS с добавлением 1% сахарозы и 0,8% агара, расслаивают в течение 2-4 дней при 4 ° С и растут на вертикально ориентированных планшетах при 22 ° С в 16 Ч свет / 8 ч темный режим. Для визуализации боковых корней расти растения в течение 7-10 дней перед переносом в камеры формирования изображения. </li><li> Чтобы закрыть камеру, нанесите покровное стекло, соответствующее оптике объектива, аккуратно надавив на нее острием стеклянного микроскопа до покровного стеклаЛежит на обеих стеклянных полосках ( рисунок 1Н ). </li><li> Закрепите покровное стекло полосками шириной 1,25 см с микропорной хирургической лентой, разрезанной пополам по длине на каждом конце, если это желательно ( рис. 1I ). Дайте образчику остыть в течение примерно 30 мин до получения изображения. Это минимизирует перемещение образца во время изображения. </li><li> Выполняйте визуализацию с помощью вертикального микроскопа, чтобы сохранить контролируемый субстрат для роста. Используйте цели 20X / 0.7NA или 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

<ol>
	<li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22 (2015).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+water.">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium.">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update:+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology,+physiology,+development+and+cell+biology.">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140 (2014).</li><li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+in+liquid+perfluorocarbons.">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues.">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+thickness+dependence+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+membranes.">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li><li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis.">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li><li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set.">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li><li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis.">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430 (2011).</li><li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis.">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li><li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li><li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel.">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Представленный здесь метод представляет собой простую стратегию для конфокальной визуализации высокого разрешения развивающихся боковых корней в течение двух и до трех дней. Для периодов до 48 ч не наблюдалось отрицательных эффектов системы формирования изображения на развитие боковых корней. Через 48 часов средний рост боковых корней начал замедляться, хотя значительное количество корней (37%) продолжало расти со скоростью, сопоставимой со средним ростом корня на пластинах. Поэтому при визуализации достаточно большого количества корней можно исключить корни, рост которых замедляется через 48 часов. Систематические тесты камер визуализации не проводились в течение более чем 72 часов, но рекомендуются альтернативные стратегии, если желательны длительные периоды визуализации. Камеры отображения могут оставаться на стадии микроскопа непрерывно, если имеются подходящие условия окружающей среды, или удаляться в средство роста и периодически возвращаться в микроскоп. Это позволяет отображать многочисленные камеры параллельно. &lt;/ Р&gt; Одно из преимуществ описанных здесь камер состоит в том, что боковые корни фиксируются в их положении и могут быть отображены с использованием линз с погружением в воду с высоким разрешением. Пространственная стабильность критически зависит от концентрации агара, используемой в плите опорного агара. Сначала тестировали диапазон различных концентраций от 0,8% агара до 2% агара, показав, что высокие концентрации в этом диапазоне стабильно фиксируют корни в пространстве, но рост корней замедляется быстрее, а некоторые корни проявляют признаки механического напряжения, в том числе уменьшенное удлинение клетки. Напротив, низкие концентрации агара не обеспечивали необходимую поддержку, и корни дрейфовали по x, y и z во время получения изображения. Оптимальная 1,5% агаровая плита фиксирует положение образца без неблагоприятных механических воздействий. В этих условиях после оседания в первые 30 мин или около того корни стабильны в течение многих часов, что позволяет получать данные за ночь. Во время сбора 4D-данных диапазоны z-стека обычно были bРэкетом еще на 5-10 мкм, но это было главным образом для обеспечения внеплоскостного роста боковых корней, а не z-дрейфа или колебания. Хотя стандартная концентрация агара обеспечивает некоторое сопротивление проникновению, гравитропно растущие корни, в конечном счете, проникают в агар. Тем не менее, благодаря незначительной модификации камеры формирования изображения, рост корня можно поддерживать параллельно покровному стеклу, позволяя визуализировать более старые боковые корни и первичные корни. Кроме того, базовую камеру формирования изображения можно легко настроить для гипокотилей. Гипокотилы более свободно плавают в этой системе, поэтому скобка для оси Z для получения изображения обычно увеличивается примерно до 20 мкм. В этом исследовании по всему периметру использовался вертикальный микроскоп, который позволял контролировать свойства субстрата. Камера формирования изображения может быть адаптирована к конфигурации инвертированного микроскопа, но необходимо будет оценить зависящее от времени влияние жесткого покровного стекла на перехватывающие органы. </p&gt; Литлджон и коллеги указали, что сам ПФО не легко растворяет биологические молекулы, а значит, он не может быть использован непосредственно для доставки фармакологических соединений 7 . Эта проблема была решена путем подачи таких соединений через плиту затвердевшей питательной среды, на которой лежит агарная плита. В то время как перфузионные системы остаются методом выбора для экспериментов по промыванию, камера формирования изображения успешно использовалась для введения дексаметазона 12 и других соединений. Одно замечание, в то время как эта статья была в стадии подготовки, фон Вагенхайм и его коллеги [ 18] описали камеру для визуализации развития боковых корней с использованием микроскопа с использованием листа.

Для изучения клеточных и субклеточных процессов, лежащих в основе развития растений, растет спрос на долгосрочные технологии получения изображений с высокой разрешающей способностью. Ключевая проблема в таких экспериментах по визуализации заключается в поддержании физиологических условий, включая достаточный газообмен, плюс подачу воды и питательных веществ 1 , 2 , 3 . Чтобы использовать цели с высокими числовыми отверстиями для оптимального оптического разрешения, образцы должны располагаться в непосредственной близости и ориентироваться параллельно покровному стеклу. Движение в направлениях x, y и z в идеале должно быть минимальным во время изображения. Хотя сеянцы часто устанавливают в воде или водном растворе для кратковременной визуализации, вода обладает низкой способностью растворять CO 2 и O 2 (1,54 мг / мл и 0,04 мг / мл соответственно при 20 o C, 0,1 МПа) 4 , что делаетОн непригоден для длительных экспериментов. Системы перфузии, которые поддерживают постоянный уровень кислорода и питательных веществ, являются одним из решений этой проблемы и разработаны для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) 1 , 2 , 3 и световой листовой микроскопии (LSM) 5 . Такие системы, как RootChip 2 и RootArray 3 , были специально разработаны для визуализации временных развитий развивающихся корней и включают проращивание семян в устройстве для создания нескольких образцов на заказ. Эти устройства обеспечивают минимальное механическое возмущение и предназначены для параллельного анализа нескольких сеянцев, но не оптимизированы для визуализации субклеточных структур. Кальдер и его коллеги разработали более сложную камеру для получения изображений на основе перфузии, оптимизированную для визуализации субклеточных структур, в которых образец удерживается на месте сеткойЧтобы позволить использовать линзы с большим увеличением 1 . Представленное здесь альтернативное, простое решение этой проблемы, которое основано не на перфузионных системах, но использует перфтордекалин (PFD), перфторуглерод, который недавно приобрел популярность в качестве монтажной среды для изображений Arabidopsis 6 , 7 , 8 . В таких применениях высокая пропускная способность PFD для растворения CO 2 и O 2 (1,9 г / мл для O 2 в PFD по сравнению с 0,04 мг / мл в воде) 9 позволяет осуществлять газообмен в погруженной ткани. Кроме того, ПФО не флуоресцентный и его показатель преломления (1,313) сопоставим с показателем преломления воды (1,333) и ближе к цитозолу (1,4), чем по воздуху (1,000) 6 . Сообщается, что перфторуглероды оказывают минимальное физиологическое воздействие на различные растения и растенияВопросы 6 , с семенами редьки легко прорастают при погружении в ПФО и демонстрируют нормальный рост и развитие в течение по крайней мере двух полных дней, когда снабжаются водой 10 . Аналогичные наблюдения были сделаны для прорастания семян Arabidopsis 6 . На основании ВКР-рассеяния, чтобы непосредственно отобразить распределение ПФО в тканях листьев Arabidopsis после инфильтрации, Литлджон и коллеги заключают, что ПФД, вероятно, не поглощается живыми клетками 8 . Ранее ПФД использовался преимущественно для аэрофотосъемки изображения, где он значительно увеличивает глубину изображения, поскольку он легко проникает в воздушные пространства из-за его низкого поверхностного натяжения 6 . Здесь ПФО принимается для долгосрочного конфокального изображения развивающихся латеральных корешков. В этой конфигурации одну или несколько проростков помещают на плиту питательной среды, отвержденной агаром и погруженной в ПФД. PFD позволяет gВ результате чего достигается равномерный обмен в камере визуализации, предотвращающий аноксию. PFD является очень летучим, поэтому он удерживается прокладкой из полидиметилсилоксановой смолы, которая также обладает высокой газопроницаемостью (1,5 × 10 -12 пмоль / м · с -1 Па -1 для CO 2 ) 11 . Питательные вещества и вода подаются слябом из среды, отвержденной агаром. В то же время эта агарная плита мягко прижимает корень к покровному стеклу, фиксируя его относительное положение в камере формирования изображения и позволяя использовать линзы с погружением в воду с высоким разрешением. Кроме того, агарную плиту можно использовать для введения ряда фармакологических обработок, включая дексаметазон, оризалин и изоксабен. Камера формирования изображения может быть собрана в большом количестве со стандартных слайдов для микроскопа, используя минимальное оборудование. Камеры визуализации были разработаны и охарактеризованы для изучения развития боковых корней, но адаптированы к визуализации других органов рассады, таких как наконечники первичного корня игипокотиль.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Perfluorodecalin</td>
			<td style="width:191px;">F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td>
			<td style="width:119px;">FLUTEC PP6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Poly(dimethylsiloxane) gum&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td>
			<td style="width:119px;">Item # 132700</td>
			<td style="width:167px;">Carolina Observation Gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cavity Microscope Slides</td>
			<td>VWR International Ltd, Lutterworth,&#160;UK</td>
			<td style="width:119px;">10118-600</td>
			<td>Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td style="width:119px;">604753</td>
			<td>Any &#39;super-glue&#39; suitable for glass will probably suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cellulosic cellophane membrane</td>
			<td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td>
			<td colspan="2">325P cellulose film; 80mm disc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Некоторые аспекты развития растений, такие как морфогенез боковых корней, происходят во временных промежутках в несколько дней. Для изучения лежащих в основе клеточных и субклеточных процессов необходимы стратегии микроскопии с высоким разрешением, которые сохраняют физиологические условия. Ткани растений должны иметь достаточное количество питательных веществ и воды с устойчивым газовым обменом, но при погружении и иммобилизации под покровным стеклом они особенно чувствительны к гипоксии. Одна из стратегий, которая была успешно применена, заключается в использовании перфузионной системы для поддержания постоянной подачи кислорода и питательных веществ. Однако такие меры могут быть сложными, громоздкими и требуют специального оборудования. Представленная здесь альтернативная стратегия для простой системы визуализации с использованием перфтордекалина в качестве иммерсионной среды. Эта система проста в настройке, требует минимального оборудования и легко устанавливается на подставку микроскопа, позволяя устанавливать и отображать несколько камер визуализации по номиналуаллель. В этой системе скорости роста боковых корней неотличимы от темпов роста в стандартных условиях на чашках с агаром в течение первых двух дней, а рост боковых корней продолжается со сниженными скоростями, по меньшей мере, в течение еще одного дня. Ткани растений снабжаются питательными веществами через агар-сляб, который также может использоваться для введения ряда фармакологических соединений. Система была создана для мониторинга развития боковых корней, но легко адаптируется к изображениям других органов растений, таких как гипокотилии и первичные корни.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Представленная здесь простая методика для конфокальной высококонтрастной визуализации развития корня и гипокотиля с высокой разрешающей способностью на срок до 3 дней с использованием высоких численно-апертурных целей и перфтордекалина в качестве иммерсионной среды.

Простая камера для долговременной конфокальной визуализации развития корней и гипокотилов

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Затопленный фильтр Сэндвич Бумага для долгосрочного<em&gt; Ex Ово</em&gt; Время покадровой обработки изображений раннего куриных эмбрионов

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Живой конфокальной визуализации Развития Arabidopsis Цветы

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Универсальный способ крепления для Long Term Визуализация данио развития

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Долгосрочный Живая съемка<em&gt; Drosophila</em&gt; Диски глаз

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Долгосрочные последствия поведенческих и репродуктивного эмбриональных воздействия низких доз ядовитых веществ

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Конфокальный живых изображений меристем апикальной стрелять из различных видов растений

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...