Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

העבודה מומן על ידי המועצה למחקר גרמני (DFG) עם מענקים לא. SFB-938-M ו- SA 393/3-4.

1. הכנת פאן-לויקוציטים
<ol><li>צייר 1 מ"ל של דם היקפיים תורם בריא (או החולה) במזרק heparinized. הקפד לקבל אישור על-ידי ועדת האתיקה אחראי על תרומת דם.</li>
	<li>לערבב 1 מ"ל של ציוד היקפי האנושי דם עם 30 מ של מאגר פירוק ACK (150 מ מ NH4קלרנית, 1 מ מ KHCO3ו- 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.0) בשפופרת 50 מ ל, תקופת דגירה של 8 דקות בטמפרט...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר כימות של המערכת החיסונית הסינפסות. בין תאי T אנושיים (ex-vivo) נגמ שים. ראוי לציין, פן כדוריות דם אדומות-lysed-לויקוציטים שימשו כמקורות T-cell, ביצוע פעולות טיהור T-cell לוותר. הקו תא B-cell לימפומה ראג'י שימש הפונדקאית נגמ שים. זה נושא יתרונות משמעותיים, שכן הוא מאפשר השוואות ?...

תאי T הרגולטורים העיקריים של מערכת החיסון מסתגלת, מופעלים באמצעות פפטידים antigenic המוצגים בהקשר של מתחמי histocompatibility הגדולות (MHC). הפעלה מלאה של תא T דורש שני אותות, האות כשירות באמצעות הקולטן תא T אנטיגן ספציפי (TCR) / CD3 מתחם, האות costimulatory באמצעות קולטנים אביזר. שני אותות שנוצרו באמצעות האינטראקציה הישירה של תאי T עם אנטיגן תאים (נגמ שים). נגמ שים בוגרים מספקים את האות מיומנות להפעלת T-cell דרך MHC-פפטיד מתחמי, הם מבטאים ליגנדים costimulatory (למשל, CD80 או CD86) כדי להבטיח את ההתקדמות של T-cell הפעלה1. פונקציה חשובה אחת של costimulation היא התארגנות מחודשת של3,42,שלד התא אקטין. בקליפת המוח F-אקטין היא סטטית יחסית ב נח בתאי T. תא T גירוי דרך מניבי אנטיגן נגמ שים מוביל שחלוף עמוקה של שלד התא אקטין. אקטין דינמיקה (קרי, אקטין מהר פלמור/depolymerization מעגלים) מאפשרים תאי T ליצור כוחות אשר משמשים להעברת חלבונים או organelles, למשל. יתר על כן, שלד התא אקטין חשוב לפיתוח אזור קשר מיוחד בין תאי T נגמ שים, שנקרא הסינפסה המערכת החיסונית. בשל חשיבות שלד התא אקטין את הסינפסה המערכת החיסונית, זה הפך חיוני לפתח שיטות כדי לכמת שלד התא אקטין של T תאים5,6,7,8 שינויים , 9.
על-ידי סיוע cytoskeletal אקטין, קולטנים משטח וחלבונים איתות מובדלים באשכולות הפעלה סופרא מולקולרית (SMACs) בתוך הסינפסה המערכת החיסונית. היציבות של הסינפסה המערכת החיסונית מובטחת על ידי קשירה של קולטני חבילות F-אקטין המגבירים את האלסטיות של שלד התא אקטין. היווצרות סינפסה החיסון הוכח להיות קריטית עבור הדור של ההיענויות החיסון מסתגלת. השפעות מזיקות של צורה פגומה סינפסה המערכת החיסונית ויוו התממשו קודם בחולים הסובלים מ תסמונת אולדריץ ויסקוט (WAS), מחלה אשר פלמור אקטין, / ת, נגרמת הפרעה היווצרות מערכת החיסון סינפסה10 . היה מטופלים עלולים לסבול אקזמה, דלקות חוזרות ונשנות חמורים, מחלות אוטואימוניות, מלנומה. למרות ממצא זה, כרגע לא ידוע אם המערכת החיסונית סינפסה היווצרות שונה בתאי T אנשים בריאים וחולים הסובלים החיסון מולדים או מחלות אוטואימוניות.
מיקרוסקופ פלורסצנטיות, כולל וידאו, TIRF, סופר-רזולוציה מיקרוסקופ, שימשו לגלות את הארכיטקטורה המערכת החיסונית סינפסה11,12,13,14. הרזולוציה הגבוהה של מערכות אלה ועל האפשרות של ביצוע הדמיה לחיות תאים מאפשרת איסוף מידע מדויק, -עתיים על שלד התא של אקטין, פני שטח או תאיים חלבונים ב הסינפסה המערכת החיסונית. עם זאת, תוצאות רבות, מבוססות על ניתוח רק כמה עשרות תאי T. יתר על כן, תאי T חייבים להיטהר עבור סוגים אלה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עבור שאלות מחקר רבות, השימוש של תאים ולזרימה ולא את הרזולוציה הגבוהה ביותר-האפשר זאת, חשיבות עליונה. זה רלוונטי אם T תאים מחולים מנותחים, שכן כמות הדם שנתרמו מוגבל, ייתכן שיש צורך לעבד דוגמאות רבות במקביל.
הקמנו שיטות מיקרוסקופיים לאפשר הניתוח של שלד התא אקטין ב הסינפסה מחוסן16,15,המערכת האנושית17. שיטות אלה מבוססות על הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ18. כמו הכלאה בין זרימה מולטי ספקטריאליות cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הדמיה cytometry זרימה יש הייתרונות בניתוח מורפולוגי פרמטרים ולוקליזציה חלבון באוכלוסיות הטרוגניות התא, כגון פאן-לויקוציטים מ דם היקפיים. הצגנו מתודולוגיה המאפשרת לנו לכמת F-אקטין ב- T-תא/APC conjugates של תאים אנושיים T מדגימות דם מלא, ללא צורך זמן רב ויקרות טיהור צעדים17. הטכניקה המובאת כאן כוללת כל זרימת העבודה, מלקבל את דגימת הדם על כימות של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

הסינפסה החיסון הוא האזור של תקשורת בין תאי T, תאים אנטיגן (נגמ שים). תאי T polarize רצפטורים משטח וחלבונים לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית כדי להבטיח איגוד יציב אות exchange. מיקרוסקופ קונפוקלי, TIRF או רזולוציה סופר קלאסי שימשו ללמוד הסינפסה המערכת החיסונית. מאז שיטות אלו דורשות ייבוא תמונות ידנית, כימות גוזלת זמן, ההדמיה של מאורעות נדירים הוא מאתגר. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המאפשרת ניתוח מורפולוגי של עשרות אלפי תאים. הסינפסות המערכת החיסונית הם המושרה בין ראשי בתאי T אנושיים בהכנות פאן-ליקוציט Staphylococcus aureus enterotoxin ראג'י טעון-B SEB תאים כמו נגמ שים. ייבוא תמונות מתבצע באמצעות הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ, המשלבת תכונות של cytometer זרימה של מיקרוסקופ זריחה. אסטרטגיה חסימה מלאה לזוגות תא T/APC ואבחון הסינפסות החיסון הינו מסופק. כאשר זרימת עבודה זו מאפשרת הניתוח של החיסון synapses בהכנות ולזרימה פאן-ליקוציט ודורש ומכאן רק נפח קטן של דם (קרי, 1 מ"ל), ניתן להחיל אותה על דגימות מחולים. חשוב לציין, מספר דגימות מוכן, ולהשוואה ניתח במקביל.

יעד מרכזי של השיטה המתוארת כאן היא כימות של העשרה חלבונית (למשל, F-אקטין) ב הסינפסה המערכת החיסונית בין אם פונדקאית נגמ שים (ראג'י תאים) ותאי T ב ולזרימה פאן-לויקוציטים נלקחו דגימות דם אדם בנפח נמוך (1 מ"ל). צילום מסך באיור 1 נותן סקירה של האסטרטגיה המגביל קריטי של...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגי האנושי, כגון כיצד תקשורת בין לויוציטים מתרחשת ברמה המולקולרית והתאירית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי תאי T אנושיים unpurified ניתן לנתח ex vivo בתקופה קצרה יחסית. הוכחת הליך זה תהיה הנינג קירשגסנר, טכנאי מהמעבדה שלנו.התחל על ידי ערבוב מיליליטר אחד של דם היקפי אנושי שנמשך טרי עם 30 מיליליטר של חיץ תזה ACK בצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר שמונה דקות בטמפרטורת החדר, ממלאים את הצינור ב- PBS לשטיפת צנטריפוגה ומבזבזים את גלולה בשני מיליליטר של מדיום תרבות עבור דגירה של 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להוסיף חמש פעמים 10 כדי Staphylococcus aureus enterotoxin B או SEB טעון או נפרק תאים ראג'י ב 500 microliters של תרבות בינוני לתוך צינורות FACS בודדים, ואחריו 650 microliters של פאן-לויקוציטים.לסובב את התרבויות שיתוף, ו resuspend כדורי ב 150 microliters של מדיום תרבות טרי עבור דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מערבולת עדין את התאים במשך 10 שניות ב 100 סל"ד תוך הוספת 1.5 מיליליטר של 1.5% paraformaldehyde. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, להפסיק את קיבעון עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת 1%BSA ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.תוסיפו את הכדורים ל-100 מיקרוליטרים של PBS פלוס BSA ו-0.1% סאפונין, ותוסיפו את דגימות התא לשתי בארות בודדות של צלחת U-bottom עם 96 בארות. לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הצלחת מחדש את כדורי ב 50 microliters של PBS בתוספת BSA ו סאפונין המכיל את נוגדנים פלואורופור הוסיף או תרכובות עניין עבור דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים ב 150 microliters של PBS בתוספת BSA וסאפונין ולתלות את כדורי ב 60 microliters של PBS.כדי לדמיין את התאים לפי ציטומטריית זרימה, פתח את תוכנת הניתוח, בדוק את הרמה הנוזלית ולחץ על הפעלה בתפריט מכשיר. לאחר מכן, לחץ על טען וטען את הדגימות ליציאה כשתתבקש לעשות זאת. תחת הכרטיסיה תאורה, שנה את כוח הלייזר של העירור לאורכים המתאימים של הננומטר.לאחר מכן, התאימו את השערים לערוצים 4 ו-11 והתאיימו את האזור לערוץ הראשון. כדי להעריך את התאמות הכוח של gating ולייזר, העבר את תפריט תצוגה לשער המתאים והתאם את השערים וכוחות הלייזר עד שהתאים וזוגות התאים יהיו גלויים. לאחר מכן, בכרטיסיה רכישת קבצים, הגדר את השם לדוגמה ואת מספר התמונות שיש לרכוש ואת השער המתאים עבור כתמי CD3 ולחץ על רכוש כדי להתחיל ברכישה.כדי לנתח את תמונות התאים שנרכשו, פתח את תוכנת הניתוח המתאימה. בהתאם להוראות ברשימה הנפתחת פיצוי, לייצר מטריצת פיצוי ולשמור את המטריצה כמו ctm תאריך comp. לאחר מכן, פתחו קובץ תמונה גולמי לדוגמה והחלו את ctm תאריך ה-comp בחלון כדי ליצור את התמונה המפוצה ואת קבצי ניתוח הנתונים המוגדרים כברירת מחדל.לאחר פתיחת קובצי התמונה המפוצים, המירו את התמונות למצב צבע. התאם את טבלאות בדיקת המידע כדי לקבל צבעים גלויים מיטביים בסרגל הכלים מאפייני גלריית תמונות. פתחו את מנהל המסכות בתפריט 'ניתוח' והגדירו את תאי T על-ידי בחירת מסיכת סף של 60% לערוץ 5 ומילוי המסיכה ליצירת מסיכת תא T.לאחר מכן, בחרו 'מסיכת עמק' לערוץ 2 ברוחב של שלושה פיקסלים ליצירת מסכת העמק, ושלבו את מסכות התא T והעמק ליצירת מסיכת הסינפסה של תאי T. כדי לחשב את הביטוי הכולל של CD3 בתאי T, פתח את מנהל התכונות וצור את התכונה עוצמה, תא T, ערוץ חמש. כדי לחשב את הכמות הכוללת של F-actin בתאי T, צור את התכונה עוצמה, תאי T, ערוץ שש.כדי להעריך את כמות ה- CD3 בסינאפסות חיסוניות, צור את התכונה עוצמה, סינפסה של תאי T, ערוץ חמש. כדי לקבוע את כמות F-actin בסינאפזה החיסונית, ליצור את התכונה עוצמה, סינפסה תא T, ערוץ שש. לבסוף, כדי להגדיר את העשרת F-actin ו- CD3, לחשב את היחסים של F-actin או CD3 בסינאפזה החיסונית ואת הביטוי הכולל של החלבון שנבחר, בהתאמה.בגרפים אלה, סקירה של אסטרטגיית gating קריטי לכמת את העשרת החלבון בסינאפסה החיסונית בין תאים מציגי אנטיגן פונדקאית, או APCs, ותאי T ב pan-leukocytes unpurified נלקח מדגם דם אנושי בנפח נמוך מוצג. כאן מוצגות תמונות מייצגות של T-cell-APC עם רמות נמוכות של CD3 ו- F-actin בתוך הסינפסות החיסונית שלהם בהיעדר SEB, ואילו אלה T-cell-APC conjugates להפגין העשרה חזקה CD3 ו- F-actin בנוכחות SEB. בהיעדר סופראנטיג'ן, 15% מתאים T הציגו העשרה של CD3 ו- F-actin בסינאפזה החיסונית, ואילו העשרה של 29% נצפתה בנוכחות סופראנטיג'ן.ואכן, בהיעדר סופראנטיג'ן, פחות מ-20% מכלל ה-F-actin בתאים מצטבר בסינפסה החיסונית, עם יותר מ-30% שנצפו בסינאפסה בנוכחות סופרנטיגן. יש לציין, CD3 מצטבר על הסינפסה החיסונית גם בהיעדר סופראנטיגן, אם כי הצטברות זו גדלה באופן משמעותי גם על ידי תוספת של סופראנטיג'ן, המדגים את הכושר של שיטה זו לכמת הצטברות חלבון בסינתפסה החיסונית T-cell-APC. לאחר השליטה, טכניקה זו ניתן להשלים בשש עד שבע שעות אם מבוצע כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול את כל הפקדים הרלוונטיים, כולל דגימות ללא סופראנטיג'ן, גם אם נעשה שימוש ב- APCs ללא SEB. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות על המבנה עדין של הסינפסה החיסונית. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התקשורת התאית לחקור את הסינפסה החיסונית בבני אדם למחקר בסיסי, ניסויים קליניים ומדעי התרגום.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לנתח את אזור החיבור T-cell-APC ואת הסינפסה החיסונית בתאי T אנושיים ex vivo. אל תשכח כי עבודה עם חומרים אנושיים ראשוניים יכול להיות מסוכן, כי אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות או עבודה תחת רמה biosafety שני תנאים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...