Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

仕事で賄われていたドイツの研究議会 (DFG) 助成金で no.SFB-938-M と SA 393/3-4。

1. 汎白血球の準備
<ol><li>ヘパリンの注射器、健康なドナー (または患者) から末梢血 1 mL を描画します。献血活動に責任がある倫理委員会の承認を持っていることを確認します。</li>
	<li>ひと末梢のミックス 1 mL と 30 mL 50 mL のチューブで ACK 換散バッファー (150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3、および 0.1 ミリメートルの EDTA、pH 7.0) の血し、室温で 8 分間インキュベートします。</li>
	<li>PBS ?...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

ここで紹介するワークフロー (ex vivo) 人間の T 細胞と Apc の間の免疫シナプスの定量化が可能にします。特に、赤血球によって汎白血球は不可欠である T 細胞の精製ステップを作る T 細胞ソースとして使用されました。B 細胞リンパ腫細胞株らじおは、Apc の代理として提供しています。これはそれは免疫シナプスの T 細胞側の血液ドナー間の比較を可能にするので重要な利点を負いません。さ...

T 細胞は適応免疫システムの主要なレギュレータ、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) のコンテキストで提示される抗原ペプチドで活性化します。完全な T 細胞活性化は、2 つの信号を必要とする抗原特異的 T 細胞受容体 (TCR) を介して能力信号/CD3 複合体とアクセサリーの受容体を介した共刺激シグナル。両方の信号の生成は T 細胞抗原提示との直接相互作用を通じて細胞 (APCs)。成熟した Apc はペプチッド MHC 複合体を介して T 細胞活性化の能力の信号を提供し、彼らの共刺激リガンドを発現 (例, CD80 や CD86) T 細胞活性化1の進行を保証します。共刺激が引き起こすの 1 つの重要な機能は、アクチン細胞骨格2,3,4の再配置です。皮質の F-アクチンは T 細胞の休息で比較的静的です。T 細胞刺激抗原軸受 Apc によるアクチン細胞骨格の深遠な転位につながる.アクチン ・ ダイナミクス (すなわち,高速アクチン重合・脱重合円) は、たとえばタンパク質や細胞小器官の輸送に使用される力を作成する T 細胞を有効にします。また、アクチン細胞骨格は、T 細胞と Apc は、免疫シナプスと呼ばれる特別な接触領域を開発するため重要です。免疫シナプスにアクチン細胞骨格の重要性、原因は、T 細胞5,6,7,8のアクチン細胞骨格の変化を定量化する手法の開発に不可欠になっています,9。
アクチン細胞骨格の援助による表面受容体とシグナル伝達タンパク質は、免疫シナプス内の分子活性化クラスター (図形) で分離されます。アクチン細胞骨格の弾力性を高める F アクチン束に受容体の結合によって免疫シナプスの安定性が保証されます。免疫シナプス形成は適応免疫応答の生成に重要であること示されています。生体内で不完全な免疫シナプス形成の有害な影響は最初からウィスコットアルドリッチ オールドリッチ症候群 (WAS) で、どのアクチン重合の病を患っている患者で実現した、免疫シナプス形成を邪魔する付随して、10.された患者さんは、アトピー性皮膚炎、重症の再発性感染症、自己免疫疾患、黒色腫に苦しむことができます。この見つけることにもかかわらず、それは現在知られていない免疫シナプス形成が健常者および免疫の欠陥や自己免疫疾患患者の T 細胞の異なるかどうか。
超解像顕微鏡や全反射、蛍光顕微鏡、共焦点を含む免疫シナプス11,12,13,14のアーキテクチャを明らかにする使用されました。これらのシステムの高解像度と住セルイメージ投射を行う可能性は、アクチン細胞骨格の表面や細胞内タンパク質免疫シナプスの正確な時空についてのコレクションをできます。ただし、多くの結果は T 細胞の数の分析に基づいて作成します。また、蛍光顕微鏡のこれらのタイプの T 細胞は浄化されなければなりません。多くの研究の質問の unpurified セルではなく、可能な限り最高の解像度の使用は、最も重要であります。これは献血された血液の量が限られ、並列で多くのサンプルを処理する必要がある可能性がありますので、患者の T 細胞を分析する場合。
私たちは、人間システム15,16,17免疫シナプスのアクチン細胞骨格の分析を許可する顕微鏡の方法を確立しました。これらのメソッドは、フローサイトメトリー、フローで顕微鏡18とも呼ばれますをイメージングに基づいています。マルチ スペクトル流れフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡との間のハイブリッド、フローサイトメトリーをイメージングは形態学的パラメーターとから汎白血球などの異種細胞集団におけるタンパク質局在の分析に強み、末梢血。時間がかかり、高価な精製手順17を必要とせず、全血のサンプルからの人間の T 細胞の T 細胞/APC 抱合体のアクチンを定量化することを可能にする方法論を紹介しました。ここで紹介しているテクニックは、免疫シナプスの F-アクチンの定量化への血液サンプルから、ワークフロー全体を構成されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

免疫シナプスは、T 細胞と抗原提示細胞 (Apc) の間の領域です。T 細胞では、表面の受容器および安定したバインディングを保証し交換を知らせる免疫シナプスに向かって蛋白質を分極しなさい。クラシック共、全反射、または超解像顕微鏡は、免疫シナプスを研究に使用されています。これらの方法は、マニュアルの画像の獲得および時間のかかる数量を必要とするので、稀なでき事のイメージングは困難です。ここでは、セルの数万人の形態素解析を可能にするワークフローについて述べる。による免疫シナプスは、Apc として汎白血球の準備で主な T 細胞や黄色ブドウ球菌エンテロトキシン B SEB ロードらじお細胞間。画像取り込みは、フローサイトメトリー、流れの cytometer と蛍光顕微鏡の機能を組み合わせたフローで顕微鏡とも呼ばれますをイメージングで実行されます。T 細胞/APC カップルを特定して免疫シナプスを分析するための完全なゲート戦略を提供しています。このワークフローにより、免疫の解析は unpurified 汎白血球準備でシナプスし、故に血の量が少なく、必要として (すなわち, 1 mL)、それは患者からのサンプルに適用することができます。重要なは、いくつかのサンプル準備、測定、および分析できる並行。

ここで説明したメソッドの主要な目的は、タンパク質濃縮の定量化 (例, F アクチン) の間の免疫シナプスの Apc (らじお細胞) と少量 (1 mL) ヒトの血液サンプルから unpurified 汎白血球の T 細胞を代理します。図 1のスクリーン ショットでは、このメソッドの重要なゲートの戦略の概要を示します。それは左と右 (図 1) の解析領域のイメージ...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

ここでは、主なヒト T 細胞と抗原提示細胞の間の免疫シナプスの定性・定量分析の完全なワークフローをについて説明します。メソッドは、取得および時間の比較的短い期間内に数千の細胞像の評価イメージング cytometry 流れに基づいています。

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

この方法は、白血球間の通信が分子レベルと細胞レベルでどのように起こっているかなど、ヒト免疫学的分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、未精製ヒトT細胞が比較的短期間でex vivoを解析できることである。この手順を実証することは、私たちの研究室の技術者であるヘニング・キルヒゲスナーです。50ミリリットルの円錐チューブに30ミリリットルのACKライシスバッファーと描きたてのヒト末梢血の1ミリリットルを混合することから始めます.室温で8分後、PBSでチューブを充填して遠心洗浄し、2ミリリットルの培養培地でペレットを摂氏37度で60分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、500マイクロリットルの培養培地中の500マイクロリットルの培養培地中の5番目の黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBまたはSEBに10回10回加え、続いて650マイクロリットルの汎白血球を加える。共培養物をスピンダウンし、150マイクロリットルの新鮮な培養培地でペレットを摂氏37度で45分間培養します。その後、1.5%パラホルムアルデヒドの1.5ミリリットルを加えながら、100rpmで10秒間細胞を穏やかに渦を出します。室温で10分後、1%BSAを補充したPBSの1ミリリットルで固定を停止し、遠心分離によって細胞を収集する。ペレットをPBSプラスBSAと0.1%サポニンの100マイクロリットルに再懸濁し、96ウェルのUボトムプレートの2つの個々のウェルに細胞サンプルを追加します。室温で15分後、プレートを遠心分離し、フルオロフォア共役抗体または目的化合物を含むPBSプラスBSAおよびサポニンの50マイクロリットルのペレットを室温で暗闇の中で30分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、PBSプラスBSAとサポニンの150マイクロリットルで細胞を3回洗浄し、60マイクロリットルのPBSでペレットを再懸濁します。フローサイトメトリーでセルを画像化するには、解析ソフトウェアを開き、液体レベルを確認し、計器メニューの「起動」をクリックします。次に、[読み込み] をクリックし、プロンプトが表示されたら、サンプルをポートに読み込みます。[イルミネーション]タブで、励起レーザーの電力を適切なナノメートルの長さに変更します。次に、チャンネル 4 と 11 のゲートを調整し、チャンネル 1 の領域を調整します。ゲーティングとレーザーの電力調整を評価するには、ビューメニューをそれぞれのゲートに切り替え、セルとセルのカップルが見えるまでゲートとレーザーパワーを調整します。次に、[ファイル取得]タブで、取得するサンプル名と画像数、およびCD3染色の適切なゲートを定義し、[取得]をクリックして取得を開始します。取得したセルイメージを解析するには、適切な解析ソフトウェアを開きます。[補正] ドロップダウンの指示に従って、補正マトリックスを作成し、そのマトリックスを comp date ctm として保存します。次に、サンプルの生画像ファイルを開き、ウィンドウに comp date ctm を適用して、補正された画像とデフォルトのデータ分析ファイルを生成します。補正した画像ファイルを開いた後、画像をカラーモードに変換します。参照テーブルを調整して、[イメージ ギャラリーのプロパティ] ツールバーで最適な表示色を取得します。[解析] メニューの [マスク マネージャ] を開き、チャネル 5 の 60%しきい値マスクを選択し、マスクを埋めて T セル マスクを作成して、T セルを定義します。次に、3 ピクセルの幅を持つチャンネル 2 の[バレー マスク]を選択して、バレー マスクを作成し、T セルとバレー マスクを組み合わせて T セル シナプス マスクを作成します。T セルの合計 CD3 式を計算するには、フィーチャ マネージャを開き、フィーチャの強度、T セル、チャネル 5 を作成します。T細胞中のF-アクチンの総量を計算するには、特徴の強度、T細胞、チャネル6を作成します。免疫シナプス中のCD3量を評価するために、特徴の強度、T細胞シナプス、チャネル5を作成します。免疫シナプス中のF-アクチンの量を決定するには、特徴強度、T細胞シナプス、チャネル6を作成します。最後に、F-アクチンおよびCD3濃縮を定義し、免疫シナプス中のF-アクチンまたはCD3の比率と、選択したタンパク質の総発現量をそれぞれ計算する。これらのグラフでは、サロゲート抗原提示細胞(APC)と、少量のヒト血液サンプルから採取した未精製の汎白血球中のT細胞との間の免疫シナプス中のタンパク質濃縮を定量化するための重要な格子化戦略の概要を示す。ここでは、SEBがない場合の免疫シナプス内に低レベルのCD3およびF-アクチンを有するT細胞-APCコンジュゲートの代表的な画像が示されているのに対し、これらのT細胞APCコンジュゲートはSEBの存在下で強力なCD3およびF-アクチン濃縮を示す。超抗原がない場合、T細胞の15%は免疫シナプスでCD3およびF-アクチンの両方の濃縮を示し、一方、29%の富化は超抗原の存在下で観察される。実際、超抗原が存在しない場合、細胞内のF-アクチン全体の20%未満が免疫シナプスに蓄積し、超抗原の存在下でシナプスで30%以上が観察される。特に、CD3は、超抗原の存在下でも免疫シナプスに蓄積し、この蓄積は超抗原の添加によっても有意に増加するが、T細胞APC免疫シナプスにおけるタンパク質蓄積を定量するこの方法の適性を実証する。一度習得すれば、この技術は、正しく実行すれば6〜7時間で完了することができます。この手順を試みる間、SEBを使用しないAPCを使用する場合にもタンパク質濃縮が発生するので、スーパー抗原のないサンプルを含むすべての関連するコントロールを含める必要があります。この手順に従って、超解像顕微鏡のような他の方法は、免疫シナプスの微細な構造に関する追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、細胞通信の分野の研究者が基礎研究、臨床試験、および翻訳科学のためにヒトの免疫シナプスを探求する道を開いた。このビデオを見た後, あなたは、ヒトT細胞ex vivoのT細胞-APC結合帯と免疫シナプスを分析する方法をよく理解している必要があります.一次人体の作業は危険であり、手袋の着用やバイオセーフティレベルでの作業などの予防措置は、この手順を実行する間は常に2つの条件を取るべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

免疫・感染学

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...