Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Arbeidet ble finansiert av tyske council (DFG) med tilskudd. SFB-938-M og SA 393/3-4.

1. forberedelse av Pan-leukocytter
<ol><li>Trekke 1 mL av perifert blod fra en frisk donor (eller pasienten) i en heparinized sprøyte. Pass på at godkjenning av ansvarlig etikk for blod donasjon.</li>
	<li>Mix 1 mL av menneskelig perifere blod med 30 mL av ACK lyseringsbuffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3og 0,1 mM EDTA, pH 7.0) i et 50 mL rør og ruge i 8 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Fyll rør med PBS og sentrifuge 300 x g for 6 min. leveringstanken nedbryting og resuspend pellet i 30 m...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

Arbeidsflyten presenteres her gjør det mulig for kvantifisering av immun synapser mellom menneskelige T-celler (ex vivo) og pansrede. Spesielt ble røde blodlegemer-lysed pan-leukocytter brukt som T-celle kilder, gjør T-celle rensing trinnene unnværlig. B-celle lymfom celle linjen Raji servert som surrogat APCs. Dette bærer betydelige fordeler, siden det gjør sammenligninger mellom blodgivere av T-celle siden av immun synapse. Videre er autologous DCs neppe tilgjengelig direkte fra eksterne menneskeblod. Produksjone...

T-celler er store regulatorer av adaptive immunsystemet og aktiveres gjennom antigen peptider som presenteres i sammenheng med store histocompatibility komplekser (MHC). Full T-celle aktivering krever to signaler, kompetanse signalet via antigen-spesifikke T-celle reseptor (TCR) / CD3 komplekse og costimulatory signalet via tilbehør reseptorer. Begge signalene blir generert gjennom direkte samspill av T-celler med antigen-presentere celler (APCs). Eldre APCs gi kompetanse signalet for T-celle aktivering gjennom MHC-peptid komplekser, og de uttrykker costimulatory ligander (f.eks, CD80 eller CD86) å sikre progresjon av T-celle aktivering1. En viktig funksjon av costimulation er omorganisering av utgangen cytoskjelett2,3,4. Den kortikale F-utgangen er forholdsvis statiske i hviler T celler. T-celle stimulering gjennom antigen-bærende APCs fører til en dyp omorganisering av utgangen cytoskeleton. Utgangen dynamics (dvs., rask begrepsordbok polymerisasjon/depolymerization sirkler) aktiverer T-celler å lage styrker som brukes til å transportere proteiner eller organeller, for eksempel. Videre er begrepsordbok cytoskeleton viktig for å utvikle en spesiell kontakt sonen mellom T celler og APCs, kalt immun synapse. På grunn av betydningen av utgangen cytoskeleton til immun synapse, har det blitt nødvendig å utvikle metoder for å kvantifisere endringer i utgangen cytoskeleton T celler5,6,7,8 , 9.
Ved utgangen cellen cytoskjelett bistand, er overflate reseptorer og signalnettverk proteiner segregerte i supramolecular aktivisering klynger (SMACs) i immun synapse. Stabiliteten av immun synapse sikres ved binding av reseptorer til F-utgangen bunter som øker elastisitet i utgangen cytoskeleton. Immun synapse dannelsen har vist seg å være kritisk for generering av adaptive immunreaksjoner. De skadelige virkningene av en defekt immun synapse formasjon i vivo var skjønte hos pasienter som lider fra Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sykdom som begrepsordbok polymerisasjon og samtidig, immun synapse formasjon er forstyrret10 . VAR pasienter kan lide av eksem, alvorlig tilbakevendende infeksjoner, autoimmune sykdommer og melanomer. Til tross for dette funnet, er det for øyeblikket ikke kjent om immun synapse formasjon er forskjellig i de T-cellene friske individer og pasienter som lider av immun defekter eller autoimmune sykdommer.
Fluorescens mikroskopi, inkludert AC confocal, TIRF og super-oppløsning mikroskopi, ble brukt til å avdekke arkitektur immun synapse11,12,13,14. Den høye oppløsningen av disse systemene og mulighet til å utføre live-celle imaging muliggjør innsamling av nøyaktig spatio-temporale informasjon om utgangen cytoskeleton og overflaten eller intracellulær proteiner i immun synapse. Mange resultater, men er basert på analyse av bare noen titalls T celler. Videre må T celler være renset for disse typer fluorescens mikroskopi. Men for mange forskning spørsmål er bruk av urenset celler i stedet for den høyest mulige oppløsningen av største betydning. Dette er relevant hvis T celler fra pasienter blir analysert, siden mengden donert blod er begrenset og det kan være behovet for mange prøver parallelt.
Vi etablert mikroskopiske metoder som tillater analyse av utgangen cytoskeleton i immun synapse i mennesket15,16,17. Disse metodene er basert på imaging flowcytometri, også kalt i flyt mikroskopi18. Som en hybrid mellom multispectral flyt cytometri og fluorescens mikroskopi, imaging flowcytometri har sin styrke i å analysere morfologiske parametere og protein lokalisering i ulike celle populasjoner, for eksempel pan-leukocytter fra den perifert blod. Vi introduserte en metode som gjør det muliggjør for oss å kvantifisere F-utgangen i T-celle/APC conjugates av menneskelige T-celler fra hele-blodprøver, uten behov for tidkrevende og kostbare rensing trinnene17. Teknikken presenteres her omfatter hele arbeidsflyten blir blodprøve for kvantifisering av F-utgangen i immun synapse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

Immun synapse er det kommunikasjon mellom T celler og antigen presentere celler (APCs). T celler polarize overflate reseptorer og proteiner mot immun synapse å sikre en stabil binding og signal exchange. Klassisk AC confocal, TIRF eller super-oppløsning mikroskopi har blitt brukt til å studere immun synapse. Siden disse metodene krever manuell bildeopptak og tidkrevende måling, er avbilding av sjeldne hendelser utfordrende. Her beskriver vi en arbeidsflyt som gjør morfologisk analyse av titusenvis av celler. Immun synapser er indusert mellom primær menneskelige T-celler i pan-leukocytter forberedelser og Staphylococcus aureus enterotoksin B SEB lastet Raji celler som APCs. Bildeopptak utføres med imaging flowcytometri, også kalt i flyt mikroskopi, som kombinerer funksjonene til en flyt cytometer og fluorescens mikroskop. En komplett gating strategi for å identifisere T celle/APC par og analysere de immun synapser tilbys. Som denne arbeidsflyten analyse av immun synapser i urenset pan-leukocytter forberedelser og dermed krever bare en liten mengde blod (dvs., 1 mL), den kan brukes på prøver fra pasienter. Viktigere, kan flere prøver bli forberedt, målt og analysert parallelt.

Et hovedmål for metoden beskrevet her er kvantifiseringen protein berikelse (f.eks, F-utgangen) i immun synapse mellom surrogat APCs (Raji celler) og T-celler i urenset pan-leukocytter tatt fra lav-volum (1 mL) menneskelig blodprøver. Skjermbilde i figur 1 gir en oversikt over kritisk gating strategien med denne metoden. Det viser bilde-galleriet til venstre og analyseområdet til høyre (figur 1). Bildegalleriet viser "I fokus" porten. Avbilde...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Her beskriver vi en komplett arbeidsflyt for kvalitativ og kvantitativ analyse av immun synapser mellom primær menneskelige T-celler og antigen presentere celler. Metoden er basert på tenkelig flowcytometri, hvilke innrømmer oppkjøp og evaluering av flere tusen celle bilder i en relativt kort tidsperiode.

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i det humane immunologiske feltet, for eksempel hvordan kommunikasjon mellom leukocytter skjer på molekylært og cellulært nivå. Den største fordelen med denne teknikken er at uforlignede humane T-celler kan analyseres ex vivo i en relativt kort tidsperiode. Å demonstrere denne prosedyren vil være Henning Kirchgessner, en tekniker fra laboratoriet vårt.Begynn med å blande en milliliter nytrukket menneskelig perifert blod med 30 milliliter ACK lysisbuffer i et konisk rør på 50 milliliter. Etter åtte minutter ved romtemperatur, fyll røret med PBS for en sentrifugeringsvask og gjenoppuss pellet i to milliliter kulturmedium for en 60-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, legg til fem ganger 10 til den femte Staphylococcus aureus enterotoxin B eller SEB-lastet eller losset Raji celler i 500 mikroliter kultur medium i individuelle FACS rør, etterfulgt av 650 mikroliter pan-leukocytter.Spinn ned co-kulturer, og gjenbruk pellets i 150 mikroliter av frisk kultur medium for en 45-minutters inkubasjon på 37 grader Celsius. Deretter, forsiktig virvle cellene i 10 sekunder ved 100 rpm mens du legger til 1,5 milliliter på 1,5% paraformaldehyd. Etter 10 minutter ved romtemperatur, stopp fikseringen med en milliliter PBS supplert med 1% BSA og samle cellene ved sentrifugering.Resuspend pellets i 100 mikroliter pbs pluss BSA og 0,1% saponin, og legge celleprøver til to individuelle brønner av en 96-brønn, U-bunnplate. Etter 15 minutter ved romtemperatur, sentrifuger platen og resuspend pellets i 50 mikroliter pbs pluss BSA og saponin som inneholder fluorofor-konjugert antistoffer eller forbindelser av interesse for en 30-minutters inkubasjon i mørket ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, vask cellene tre ganger i 150 mikroliter PBS pluss BSA og saponin og resuspend pellets i 60 mikroliter pbs.Hvis du vil se av cellene ved å flytcytometri, åpner du analyseprogramvaren, kontrollerer væskenivået og klikker Oppstart i Instrument-menyen. Deretter klikker du Last inn, og laster eksemplene inn i porten når du blir bedt om det. Under belysningsfanen endrer du eksitasjonslaserkraften til de aktuelle nanometerlengdene.Deretter justerer du portene for kanaler fire og 11, og justerer området for kanal én. For å evaluere gating og laser strømjusteringer, bytt Vis-menyen til den respektive porten og justere portene og laserkreftene til cellene og celleparene er synlige. Deretter definerer du eksempelnavnet og antall bilder som skal hentes, i kategorien Filanskaffelse, og klikker hent for å starte oppkjøpet.Hvis du vil analysere de oppkjøpte cellebildene, åpner du riktig analyseprogramvare. Følg instruksjonene i rullegardinlisten Kompensasjon, produsere en kompensasjonsmatrise og lagre matrisen som komp dato ctm. Deretter åpner du en eksempel raw-bildefil, og bruker comp-dato ctm i vinduet for å generere kompensert bilde og standard dataanalysefiler.Etter å ha åpnet de kompenserte bildefilene, konverterer du bildene til fargemodus. Juster oppslagstabellene for å få optimale synlige farger på verktøylinjen Egenskaper for bildegalleri. Åpne Maskebehandling på Analyse-menyen, og definer T-cellene ved å velge en 60 % terskelmaske for kanal fem og fylle ut masken for å opprette T-cellemasken.Deretter velger du Valley maske for kanal to med en bredde på tre piksler for å opprette Valley maske, og kombinere T celle og Valley masker for å lage T celle synapse maske. Hvis du vil beregne det totale CD3-uttrykket i T-celler, åpner du Funksjonsbehandling og oppretter funksjonen Intensitet, T-celle, kanal fem. Hvis du vil beregne den totale mengden F-actin i T-cellene, oppretter du funksjonen Intensitet, T-celler, kanal seks.Hvis du vil evaluere CD3-mengden i immunsynapser, oppretter du funksjonen Intensitet, T-cellesynapse, kanal fem. For å bestemme mengden F-actin i immunsynapsen, opprett funksjonen Intensitet, T celle synapse, kanal seks. Til slutt, for å definere F-actin og CD3 berikelse, beregne forholdene til F-actin eller CD3 i immunsynapse og det totale uttrykket av det valgte proteinet, henholdsvis.I disse grafene vises en oversikt over den kritiske gatingstrategien for å kvantifisere proteinberikelsen i immunsynapsen mellom surrogatantigen-presenterende celler, eller APCer, og T-cellene i uforbake pan-leukocytter tatt fra en lavvolum menneskelig blodprøve. Her vises representative bilder av T-celle-APC-konjugater med lave nivåer av CD3 og F-actin i deres immunsynapser i fravær av SEB, mens disse T-celle-APC-konjugatene viser en sterk CD3 og F-actin berikelse i nærvær av SEB. I fravær av superantigen viste 15% av T-cellene berikelse av både CD3 og F-actin ved immunsynapse, mens en 29% berikelse observeres i nærvær av superantigen.Faktisk, i fravær av superantigen, akkumuleres mindre enn 20% av den totale F-actin i cellene ved immunsynapse, med over 30% observert ved synapsen i nærvær av superantigen. Spesielt akkumuleres CD3 ved immunsynapse selv i fravær av superantigen, selv om denne akkumuleringen også økes betydelig ved tilsetning av superantigen, noe som viser egnethet av denne metoden for kvantifisering av proteinakkumulering ved T-celle-APC immunsynapse. Når mestret, denne teknikken kan fullføres i seks til syv timer hvis utført riktig.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å inkludere alle relevante kontroller, inkludert prøver uten superantigen, da proteinberikelse også oppstår hvis APC uten SEB brukes. Etter denne prosedyren kan andre metoder som superoppløsningsmikroskopi utføres for å svare på flere spørsmål om den fine strukturen til immunsynapsen. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen cellulær kommunikasjon for å utforske immunsynapse hos mennesker for grunnleggende forskning, kliniske studier og translasjonell vitenskap.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du analyserer T-celle-APC-bindesonen og immunsynapse i humane T-celler ex vivo. Ikke glem at arbeid med primære menneskelige materialer kan være farlig, og at forholdsregler som bruk av hansker eller arbeid under biosikkerhetsnivå to forhold alltid bør tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og Rapid-protokollen til ikke-enzymatisk distansere Ferske menneskelig vev for analyse av infiltrerende Lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse av mikroglia og monocyt-avledede makrofager fra sentralnervesystemet ved hjelp av flytcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...