Name: the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies
Uploaded: 2017-02-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مرض كرون والتهاب القولون مؤسسة من أمريكا، (CCFA، 3711) الوقاية من السرطان ومعهد بحوث من ولاية تكساس، مركز UT ساوث ويسترن الطبي (CPRIT RP160169)، ونظرا لMHZ

أجريت جميع التجارب وصفها هنا باستخدام الذكور من النوع البري (C57BL6 / J) الفئران 6-8 أسابيع من العمر الاحتفاظ بها في حر (SPF) منشأة الممرض محددة في مركز الثروة الحيوانية (ARC)، UT جنوب غرب المركز الطبي. تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACU...

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

الخلايا الظهارية في الأمعاء حساسة جدا من حيث متطلبات نموها وبالتالي يصعب الثقافة. الخلايا الظهارية المعزولة عن طريق العلاج EDTA لا البقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التقليدية مثل DMEM 8. لذلك، ودراسات التفاعل المضيف الممرض باستخدام سرداب ?...

يمثل الأمعاء نظام ديناميكي يعمل كحاجز للالكائنات الدقيقة المتعايشة، وتحارب ضد مسببات الأمراض الغازية، وينظم تكوينه الميكروبي 1. الخلايا الظهارية في الأمعاء، ويتألف من المعوية والخلايا الكأسية، والخلايا بانيت والخلايا enteroendocrine، هي سكان الخلية الرئيسية التي توفر الردود دفاع المضيف ضد الجراثيم المعوية. الخلايا الكأسية تنتج mucins أن إنشاء منطقة منزوعة السلاح على الجزء العلوي من طبقة الطلائية 2. الخلايا بانيت والمعوية تنتج الببتيدات المضادة للميكروبات، السيتوكينات، والأكسجين والنيتروجين الأنواع المتفاعلة التي تشكل الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات والمساهمة في تشكيل وتكوين الجراثيم المعوية 3 و 4. بالإضافة إلى الخلايا الظهارية، والخلايا المناعية بما في ذلك الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا القاتلة الطبيعية، الخلايا الليمفاوية، واينا<html> الخلايا اللمفاوية الشركة المصرية للاتصالات في الصفيحة المخصوصة وتحت المخاطية تلعب دورا حاسما في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية من خلال إنتاج السيتوكينات، كيموكينات، وغيرها من الوسطاء 5-7. من أجل فهم كيف يمكن لنظام المناعة المخاطية ينظم الجراثيم ويوفر الحماية ضد العدوى الميكروبية، فمن المهم النظر في التفاعل المعقد للسكان الخلية غير متجانسة من القناة الهضمية. ومع ذلك، وهو نموذج في المختبر الذي يشمل جميع الميزات الموجودة في الأمعاء غير متوفر. لذلك، والدراسات الجزيئية على تفاعل المضيف الممرض في الأمعاء تشكل تحديا للغاية. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم تطوير عدة أنظمة نموذج التي تحاكي جوانب الغشاء المخاطي في الأمعاء عن التحقيق في العمليات الفيزيولوجية المرضية تشارك في الأمراض الالتهابية الأمعاء (IBD) وغيرها من اضطرابات الجهاز الهضمي 8 -= &quot;XREF&quot;&gt; 14. وغالبا ما تستخدم خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء خلد لدراسة الخلايا الظهارية استجابات محددة. ومع ذلك، لأن التعبير الجيني التفاضلية وظيفة في الخلايا خلد، حصلت على البيانات من استخدام هذه الخلايا غالبا ما لا تتطابق مع تلك التي لوحظت في الدراسات المجراة. سرداب الأمعاء عضي الثقافة برزت مؤخرا كأداة محتملة لتقييم استجابة ظهارة الأمعاء لمختلف المحفزات 13. في هذا النظام، ويسمح للخلايا الجذعية سرداب في النمو وتطوير هيكل عضوي الشكل 3D. في حين أن نظام الثقافة عضوي الشكل هو مفيد جدا لدراسة جوانب كثيرة من ظهارة الأمعاء، فإنه لا تحاكي التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والخلايا الظهارية والمنتجات الميكروبية. ثقافة فيفو السابقين من الأنسجة المعوية تقدم تمثيل أفضل للفي الجسم الحي الردود دفاع المضيف. في هذه الطريقة، وهي جزء من الأمعاء هو مثقف في لوحة الثقافة خلية خفة دمح وسائل الإعلام المناسبة السماح للأنواع المختلفة من السكان الخلية في الأمعاء وتكون نشطة عملية الأيض لمدة 48 ساعة على الأقل. وبالتالي، ثقافة فيفو السابقين من الجهاز يمكن استخدامها لقياس التعبير عن الجينات المضادة للميكروبات والردود دفاع المضيف من الأمعاء لحافز معين. وكان المحققون باستخدام نظام الجهاز ثقافة فيفو السابقين لدراسة الردود دفاع المضيف ضد العدوى الميكروبية في الأمعاء 15-21. اعتمدنا مؤخرا نظام الثقافة الجهاز لدراسة دور inflammasome في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في كولون الماوس 22. وinflammasome هي عبارة عن منصة الجزيئية لتفعيل كاسباس 1، وهو مطلوب لإنتاج نضجت IL-1β و IL-18. أظهرنا أن IL-1β و IL-18 حمل الببتيدات المضادة للميكروبات التي تقتل بشكل فعال pathobionts المتعايشة مثل كولاي </em&gt;. وكانت هذه الملاحظة بما يتفق مع زيادة عبء كولاي في كولون الماوس inflammasome معيب 22. هذا النظام وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة دور مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) وغيرها من الجزيئات المناعية الفطرية في ردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية وكذلك التسبب في اضطرابات الأمعاء مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطان القولون والمستقيم (CRC). هناك أكثر من 200 الجينات IBD قابلية، والطفرات في كثير من هذه الجينات ترتبط مع تكوين الجراثيم تغير في القناة الهضمية. ومن الأهمية السريرية كبيرة لتحديد الآلية الدقيقة التي من خلالها الجينات IBD-القابلية تنظم الجراثيم القناة الهضمية. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة لإدخال البروتوكول الأساسي من خارج الحي الثقافة الجهاز القولون وإظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن استخدام الثقافة لدراسة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في الأمعاء.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/ F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &#38; Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1b recombinan</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP10749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-18 recombinant</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP70380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Luria-Bertani Broth&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0075-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Uded to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>DU 530</td>
			<td>Used to determine E. coli count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix S (1/8&#34;), 2 mL Tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>5085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST40R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

يعرض الأمعاء بنية هياكل سرداب المتكررة التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية، propia الصفيحة التي تحتوي على الخلايا المناعية، وسدى. كل من هذه الخلايا غير متجانسة تساهم في التوازن المعوي والمشاركة في دفاع المضيف مضادات الميكروبات. لذلك، وتحديد نموذج بديل لدراسة الاستجابة المناعية والنشاط المضادة للميكروبات الأمعاء في الإعداد في المختبر هي صعبة للغاية. في الدراسات المختبرية باستخدام خلد خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء أو سرداب حتى الابتدائي عضي الثقافة لا تمثل علم وظائف الأعضاء الدقيق الأمعاء الطبيعي والمكروية لها. هنا، نحن نناقش طريقة لزراعة الأنسجة الماوس القولون في طبق ثقافة، وكيف يمكن تنفيذ هذا المجراة سابقا نظام الجهاز ثقافة في الدراسات المتعلقة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات. في التجارب التمثيلية، أظهرنا أن كولون في الثقافة الجهاز تعبر عن الببتيدات المضادة للميكروبات في التنonse إلى دخيلة IL-1β و IL-18. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات المستجيب المضادة للميكروبات التي تنتجها الأنسجة القولون في الثقافة الجهاز تقتل بكفاءة القولونية في المختبر. هذا النهج، وبالتالي، يمكن استخدامها لتشريح دور أنماط الجزيئية pathogen- ويرتبط خطر والمستقبلات الخلوية في تنظيم المعوية الاستجابات المناعية الفطرية والاستجابات دفاع المضيف مضادات الميكروبات.

وأظهرت صورة تمثيلية لكولون في الثقافة الجهاز في الشكل 1. لا تزال القطع القولون في الثقافة عملية الأيض والنشطة من الناحية الفسيولوجية. أنها تستجيب بكفاءة للمؤثرات الخارجية إضافة إلى وسائل الإعلام والثقافة. وتدفق العمل التخطيطي للإعداد للأ?...

Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; القولون ثقافة الجهاز واستخدامه في الدراسات الدفاعية المضيف مضادات الميكروبات

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

The overall goal of this procedure is to use ex vivo cultured mouse intestinal tissue to study the role of pathogen associated molecular patterns and the pattern recognition receptors for intestinal antimicrobial host defense responses.This method can help answer how innate immune pathways regulate intestinal microbiota via regulation of antimicrobial peptides.The main advantage of this technique is that the intestinal architecture remains intact while measuring antimicrobial peptides ex vivo.After euthanizing a mouse according to the text protocol, place the animal dorsal side down on a pinning board and pin the limbs.Then use 70%ethanol to spray the mouse.With presterilized dissecting scissors and forceps, make a midline incision in the peritoneum of the abdomen.Then use forceps to open the abdomen by folding the peritoneum.With dissecting forceps and scissors, separate the colon from the small intestine by cutting at the bottom of the cecum, and the other end at the rectum.Place the colon in sterile Petri dish containing ice cold PBS, and then place it on a paper towel.Use the ice cold buffer and a 20 milliliter syringe, holding a 20g needle, or an oral gavage needle, to flush the contents of the lumen of the colon until the stool is completely removed.Using scissors, cut the colon longitudinally.Then wash the tissue by placing it into ice cold PBS in a sterile Petri dish and vigorously shaking.Repeat this wash three times.With a sterile scalpel or scissors, cut the colon tissue into pieces approximately one centimeter long, then record the weight of the colon pieces.To culture colon tissue, place a cell strainer on a six well cell culture plate.Then transfer all of the colon pieces collected from one mouse into the cell strainer.Add 5 milliliters of DMEM F12 medium containing 5%FBS, one x penicillin streptomycin, and 20 micrograms per milliliter of gentamycin, completely covering the colon pieces with the medium.Incubate the tissue at 37 degrees Celsius with 5%CO2 and 95%air for two hours.Then lift the cell strainer and aspirate the medium.Next, place the cell strainer back on the well and add five milliliters of fresh medium without antibiotics.Then lift the cell strainer and aspirate the medium.Repeat the wash two more times to remove all of the residual antibiotics.Transfer the colon pieces from a single cell strainer into a single well of a sterile 12 well cell culture plate.Add one milliliter of DMEM F12 medium containing 5%FBS per one milligram of tissue, then incubate the tissue at 37 degrees Celsius, injecting 5%CO2 and 95%air for 12 hours.Following the incubation, collect the culture supernatant in a sterile 1.5 milliliter tube.Centrifuge the sample at 12, 000 times g and four degrees Celsius for five minutes.Separate the supernatant into a new 1.5 milliliter tube for the use in the bacteria killing assay and/or other immune assays.Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius until ready to perform the assay.To carry out an e.coli killing assay, inoculate e.coli into give milliliters of LB in a 15 milliliter tube.While keeping the cap on the culture tube slightly loose incubate the cell culture at 37 degrees C while shaking at 200 rpm overnight.Centrifuge the bacterial culture tube at 12, 000 times g and four degrees Celsius for 10 minutes.Then remove the supernatant and resuspend the bacterial pellet in five milliliters of ice cold PBS.Transfer one milliliter of the bacterial suspension into a cuvette and measure the optical density at 600 nanometers.Use a predetermined standard curve to calculate the colony forming units.In this experiment, assume that one optical density unit equals two times 10 to the ninth CFU per milliliter.Next, dilute the bacterial suspension to make a stock suspension of one times 10 to the fifth colony forming units per milliliter.Then transfer the previously collected colon organ culture supernatant and control media into duplicate wells of a 24 well cell culture plate.Add 10 microliters of e.coli culture into one well of the supernatant and control.Leave the duplicate wells without e.coli to confirm the colon organ culture supernatant is not contaminated.Incubate the culture at 37 degrees Celsius for one hour.After collecting colons from mice as demonstrated earlier in this video, place the colon on a sterile paper towel and use scissors to cut the colon longitudinally into three parts.Use ice cold PBS to wash each part of the colon.Then cut each part of the organ into small pieces and weigh.Transfer the colon pieces into three separate cell strainers placed on three wells of a six well cell culture plate.Add five milliliters of DMEM F12 medium containing 5%FBS, one x penicillin streptomycin, and 20 micrograms per milliliter gentamycin.Incubate the tissue at 37 degrees Celsius and 5%CO2 for two hours.After washing the colon pieces as demonstrated earlier in this video, transfer the tissue from a single cell strainer into a single well of a sterile 12 well cell culture plate.Designate the three wells as untreated, IL-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

تحسين تقنية الكفة لزراعة القلب مورين

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

اختبار فعالية المضادات الحيوية في نموذج الجسم الحي السابق من Pseudomonas aeruginosa والمكورات العنقودية أوريوس بيو فيلمز في الرئة التليف الكيسي

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...